论文部分内容阅读
摘要内容目的检测Neuregulin-1因子处理对冠状动脉平滑肌细胞增殖、迁移、存活和蛋白表达的影响。方法选用第3-6次传代的人冠脉平滑肌细胞(HCASMC),当培养的细胞铺满瓶底的90%左右或者长成融合单层后即可加入Neuregulin-1(NRG-1,下同)进行实验。依据不同浓度NRG-1处理正常或缺血缺氧培养条件下的HCASMC进行实验分组。运用MTT法检测不同浓度的NRG-1对HCASMC增殖影响,Transwe1124孔板法检测不同浓度的NRG-1对HCASMC迁移影响；Hoechst 33342核染色法检测NRG-1对HCASMC凋亡率的影响；Western blot检测正常培养条件下NRG、ErbB2/3/4、磷酸化ErbB2受体、磷酸化ErbB3受体、磷酸化ErbB4受体以及缺血缺氧条件下促血管生成因子-1(Ang-1)、促血管生成因子-2(Ang-2)和血管内皮生成因子(VEGF)在HCASMC中的表达水平。结果1、HCASMC生长特点：培养的HCASMC为贴壁细胞,形态呈成纤维样的长梭形、杆状或者蚯蚓型；缺血缺氧条件下形态比较瘦长,数量减少,生长缓慢,易成团,细胞碎片较多。2、正常培养时,HCASMC表达ErbB2/3/4、不表达NRG；加入NRG-1处理后的HCASMC磷酸化ErbB2/3/4增加(P<0.05),加入抑制剂后磷酸化ErbB2/3/4的表达减少(P<0.05)；3、不同浓度的NRG-1对HCASMC增殖影响结果不同,10ng/mlNRG-1组促进HCASMC增殖的作用最明显[(0.314±0.044)>(0.239±0.044),OD值,下同,P<0.05],在加入抑制剂后,这种促进增殖的作用是受到抑制的[(0.188±0.039)<(0.314±0.044),P<0.05)]；在加入抑制剂的50ng/mlNRG-1组,促进HCASMC增殖作用不明显[(0.227±0.045)<(0.239±.0441),P>0.05)]。4、不同浓度的NRG-1对HCASMC迁移影响结果不同,在9H内,10ng/ml组促进HCASMC迁移的作用最明显[(32.2±5.9)个>(25士3.8)个,P<0.05],在加入抑制剂后,这种促进增殖的作用是受到抑制的[(17.1±4.5)个<(32.2±5.9)个,P<0.05],在加入抑制剂的50ng/ml NRG-1组,促进HCASMC迁移作用不明显[(21.7±4.9)个<(25±3.8)个,P>0.05]。5、在荧光显微镜下,Hoechst 33342使缺血缺氧作用24H后的HCASMC凋亡细胞容易辨认,核固缩、发亮、碎裂、成团即为凋亡细胞,而细胞生长数量也明显减少,和对照组比较,缺血缺氧HCASMC凋亡率(凋亡率=凋亡细胞数/细胞总数%)增加[(12.417±3.5)%>(4.841±1.1)%,P<0.05)]；在加入NRG-1处理后的NRG-1组的细胞凋亡率,较缺血缺氧组明显降低[(6.720±1.3)%<(12.417±3.5)%,P<0.05)]；与NRG-1+抑制剂组比较,NRG-1降低凋亡率的作用被抑制[(6.720+1.3)%<(11.368±2.4)%,P<0.05)]。6、缺血缺氧时,HCASMC表达VEGF、Ang-1较对照组增加(P<0.05),加入100ng/ml的NRG-1处理后,VEGF、Ang-1的表达较缺血缺氧组增加(P<0.05),加入抑制剂后的NRG-1+抑制剂组,VEGF、Ang-1的表达减少(P<0.05),而对照组和实验组的Ang-2表达暂无明显差异(P>0.05)。结论1、HCASMC表达ErbB2/3/4、不表达NRG, NRG-1干预后,能促进HCASMC磷酸化ErbB2/3/4的表达,说明NRG-1可激活并增强NRG/ErbB信号通路；2、不同浓度的NRG-1干预对HCASMC增殖的影响不同,浓度为10ng/ml的NRG-1能明显促进HCASMC增殖,可以推测,合适浓度的NRG-1通过促进HCASMC的增殖,从而促进其在冠脉血管生成发挥作用；3、不同浓度的NRG-1干预对HCASMC迁移的影响不同,浓度为10ng/ml的NRG-1能明显促进HCASMC迁移,可以推测,合适浓度的NRG-1通过促进HCASMC的迁移,从而促进其在冠脉血管生成发挥作用。4、缺血缺氧时,NRG-1对HCASMC凋亡产生影响,主要为降低HCASMC的凋亡率,从而保护HCASMC。5、缺血缺氧时NRG-1能促进HCASMC表达VEGF、Ang-1,从而促进冠脉血管生成。