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参考H1-H15亚型禽流感病毒(AIV)的核蛋白(NP)基因序列以及H5,H6,H9亚型AIV血凝素(HA)基因共设计四对引物,建立了四对引物用以扩增AIV的NP、HA基因用于检测H5,H6,H9亚型AIV的多重RT-PCR方法。同时以H6亚型AIV为材料,对四种RNA提取方法进行了比较研究。结果多重RT-PCR对实验的三种亚型AIV尿囊液检测分别都同时出现作为型诊断的NP带和作为亚型判断的HA带;对新城疫病毒(NDV)、传染性支气管炎病毒(IBV)、传染性法氏囊病毒(IBDV)尿囊液的检测均为阴性;对三个混合两种亚型AIV的样品检测均出现相应的三条预期条带;对三种AIV尿囊液系列稀释样品作灵敏度检测,结果极限为稀释64-128倍。在RNA提取方法的比较研究中,传统的TRIzol+离心法具有灵敏度高,但提取时间长;SDS+加热法的检测成本最低,但灵敏度最低,只能检测溶液性样品;TRIzol+离心柱方法灵敏、快速,但检测成本高,不适合大批样本的检测;TRIzol+尼龙膜法检测快,成本低,较灵敏。为了构建H6亚型AIV的核酸疫苗表达载体,首先进行HA全基因的克隆与序列分析,同时选择绿色荧光蛋白基因作为报告基因,构建了HA基因与报告基因的融合基因,并克隆于真核表达载体pAVX1,再经脂质体转染BHK细胞进行体外表达实验。经序列测序表明,克隆的H6A全基因(ORF)全长1714bp,编码566个氨基酸。序列分析表明,该基因核酸、氨基酸序列与A/duck/Hainan/4/2004(H6N2)毒株有99%的相似性;分子进化分析结果显示,该基因与A/duck/Hong Kong/3600/99(H6N2)毒株亲缘关系最近。根据基因序列推测的氨基酸序列分析,蛋白裂解位点序列为—PQIETRG—,无高致病性毒株典型的裂解位点序列;构建的表达载体pAVX1-H6A-GFP经酶切鉴定已成功克隆上融合基因;在体外表达实验中,脂质体转染24h后出现微弱荧光,48h后可见较强的荧光表达,证明核酸疫苗载体构建成功。