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大豆花叶病毒(SoyAean mosaic virus,SMV)是马铃薯Y病毒属病毒,可以引起大豆的花叶和坏死,大豆花叶病毒病是大豆产区的重要病毒病害之一,严重影响大豆的产量和品质。挖掘抗病基因,探索抗病候选基因功能,对抗病育种至关重要。国内外对大豆抗SMV基因定位进行了深入地研究,利用南农1138-2和大白麻杂交组合对SC4株系的抗性基因Rsc4精细定位到110kb。本文在以往对Rsc4精细定位的基础上,对定位区间内3个候选基因的氨基酸序列进行比对,并利用QRT-PCR和VIGS技术对3个候选基因进行定量表达和沉默分析,以确定3个基因是否与大白麻对SMV的抗性相关。为获得大豆对SMV的抗性基因、明确抗性机制,进而培育转基因抗病品种奠定基础。本研究的主要结果如下:1.Rsc4候选基因的克隆及生物信息学分析前人将Rsc4抗性基因精细定位到14号染色体上,最近的两个标记间物理距离缩小到110kb。该区间预测有4个候选基因,其中三个候选基因是NB-LRR类基因,且同源性很高。本文将三个含有NB-LRR结构域的基因作为一个抗病候选基因簇进行功能分析。从抗感亲本中分别克隆三个候选基因的CDS序列,结果表明三个基因(Rsc4-1,Rsc4-2和Rsc4-3)在抗感品种中存在SNP差异。抗病品种的三个基因编码的氨基酸序列分析表明Rsc4-1与Rsc4-2和Rsc4-3同源性分别为79.89%和81.24%,Rsc4-2与Rsc4-3的同源性为84.76%。系统进化树分析结果表明:候选基因簇与已经报道的小麦白粉病抗性基因PM3、大麦条斑病抗性基因Rdg2α等有很近的亲缘关系。2.抗性候选基因的表达分析利用QRT-PCR分析表明,3个候选基因接种SMV-SC4后Rsc4-1、Rss4-2和Rsc4-3的表达量在抗感品种中有明显差异。在抗病品种中除12h时间点外,其它时间点Rsc4-1、Rsc4-2和Rsc4-3基因的相对表达量与Oh相比都有上调表达,在24h后达到稳定水平。感病品种,除Rsc4-1和Rsc4-2的相对表达量在12hpi显著升高外,Rsc4-1、Rsc4-2和Rsc4-3的相对表达量在其它时间点与Oh对照相比均下调表达,且最终达到稳定水平。由于SMV-SC4的诱导,在抗感品种之间该基因簇的表达存在显著差异,因此,推测它们可能参与了大豆抗SMV-SC4的过程。3.利用VIGS研究大豆抗大豆花叶病毒候选基因的功能通过分析比较大白麻中-Rsc4-1、Rsc4-2和Rsc4-3的核苷酸序列,将基因簇的459bp保守序列插入BPMV-pGG7R2多克隆位点,构建沉默载体pGG7R2-Rsc4。大白麻接种沉默载体后,通过表型观察、ELISA检测及QRT-PCR分析表明,BPMV-Rsc4能成功侵染大白麻并且与空载对照相比基因簇相对表达量下调了 78%。分别对基因簇的每个基因进行QRT-PCR分析,结果表明Rsc4-1、Rsc4-2和Rsc4-3与空载对照相比基因相对表达量分别下降了 93%、42%和88%。基因簇沉默的大白麻接种SMV-SC4后,对接种SMV叶片进行双抗体夹心酶联免疫吸附分析(DAS-ELISA),检测结果呈SMV阳性。QRT-PCR分析SMV-CP基因的相对表达量,结果表明大白麻基因簇沉默后接种SMV叶片的SMV-CP基因的相对表达量与对照相比极显著升高,在接种SMV后3d,6d,9d的接种叶与接种BPMV空载对照相比分别高出39倍、2.5倍、346倍。观察系统叶的表型变化,叶片出现更严重的花叶和皱缩,并且表现出明显的向下卷曲表型,整株植物有顶端坏死症状。大白麻沉默该基因后表现感病,表明该基因簇参与了大豆对SMV的抗性过程。