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目的探讨快慢转法及不同滤膜和显色检测法在Western blotting中的应用及各实验环节分析。方法采用MDA-MB-231细胞制备细胞蛋白,应用不同印迹膜(硝酸纤维素膜、聚偏乙烯二氟(PVDF)膜和阳离子尼龙膜)分别采用快转法和慢转法进行增强化学发光法(Enhanced chemilluminescence,ECL)和二氨基联苯胺(Diaminobenzidine, DAB)化学显色法检测,并对Western blotting的各实验环节进行了分析。结果1.在快慢转法中硝纤膜的蛋白预染marker条带略强于尼龙膜,而尼龙膜又略强于PVDF膜; PVDF膜和尼龙膜的正反面易于混淆,而硝纤膜的正反面不易混淆。2.在快慢转法中,PVDF膜的DAB化学显色法图像略强于尼龙膜和硝纤膜,而尼龙膜和硝纤膜无明显差异;与慢转法相比,快转的硝纤膜和尼龙膜中的蛋白条带略呈波浪状。3.在慢转法中三种膜化学发光法的图像无明显背景,但在快转法中尼龙膜的背景较明显,而硝纤膜和PVDF膜亦无明显背景。结论应根据实验需要选用不同的印迹膜;慢转法通常优于快转法,增强化学发光法优于DAB化学显色法;增强化学发光法特异胜强、灵敏度高,是分析蛋白质表达较为理想的方法。第二部分Y14和Upf1在人乳腺癌细胞与正常乳腺细胞中的表达及意义目的研究Y14和Upf1在人乳腺癌细胞株与人乳腺细胞株的表达及意义。方法应用Western blotting、RT-PCR和Northern blotting等方法测定Y14和Upf1在乳腺癌细胞株MCF-7、ZR-75-30、T47D、MDA-MB-435s、MDA-MB-453、MDA-MB-231与乳腺细胞株HBL-100中的表达情况。结果①Y14和Upf1在乳腺癌细胞株与正常乳腺细胞株的表达水平上有明显差异,6株乳腺癌细胞的Y14和Upf1表达明显高于乳腺细胞株(P<0.05)。②在6株乳腺癌细胞株中,MDA-MB-231的Y14和Upf1表达明显高于MCF-7(P<0.05)。结论NMD在乳腺癌细胞株中的作用明显强于正常乳腺细胞株。乳腺癌细胞株中,恶性潜能高的细胞株NMD降解机制的作用强于恶性潜能低的细胞株。第三部分Y14和Upf1在乳腺癌组织、良性肿瘤组织及癌旁乳腺组织中的表达及意义目的研究Y14和Upf1在乳腺癌组织、良性肿瘤组织及癌旁乳腺组织的表达及意义,以及人乳腺癌组织中Y14和Upf1的表达与临床病理特征的关系。方法应用Western blotting, RT-PCR和Northern blotting等方法测定Y14和Upf1在乳腺癌组织、良性肿瘤组织及癌旁乳腺组织的表达情况。结果①Y14和Upf1在乳腺癌组织,良性肿瘤(纤维腺瘤)及癌旁乳腺组织的表达水平上结果差别有明显差异,乳腺癌组织的Y14和Upf1表达明显高于良性肿瘤及癌旁乳腺组织(P<0.05)。②在乳腺癌中,组织学Ⅲ级组的Y14和Upf1表达明显高于Ⅰ和Ⅱ级组(P<0.05)。③有淋巴结转移的腋窝淋巴结(+)组的Y14和Upf1表达高于腋窝淋巴结(-)组(P<0.05)。④乳腺癌CerBb-2(+)组的Y14和Upf1表达高于CerBb-2(-)组(P<0.05)。⑤乳腺癌ER(-)组的Y14和Upf1表达和ER(+)组的差别无统计学意义(P>0.05)。⑥乳腺癌PR(-)组的Y14和Upf1表达和PR(+)组的差别无统计学意义(P>0.05)。⑦乳腺癌≤2cm组的Y14和Upf1表达和>2cm组的差别无统计学意义(P>0.05)结论NMD的作用在乳腺癌组织中明显增强。Y14和Upf1的表达在组织学Ⅲ级和腋窝淋巴结转移(+)及CerBb-2(+)乳腺癌组织中表达增高,与ER、PR状态及肿瘤大小无关。NMD作用在恶性程度高的乳腺癌组织中明显增强。第四部分Y14蛋白shRNA表达载体的构建和鉴定目的在人乳腺癌细胞中构建及鉴定Y14蛋白shRNA表达载体方法按照Elbashir等及Reynolds的设计原则设计并合成针对Y14蛋白编码基因Y14的shRNA,并克隆入转录载体pGenesil-1,构建重组质粒pshRNA1- Y14,pshRNA2- Y14和pshRNAHK- Y14(阴性对照质粒);中量提取重组质粒,采用LipofectamineTM 2000转染人乳腺癌细胞MDA-MB-231和MCF-7,应用RT-PCR和Western Blot法分别在mRNA和蛋白水平检测Y14基因的干扰效果。结果成功构建三个重组质粒,分别为pshRNA1- Y14、pshRNA2- Y14和通用阴性对照质粒pshRNAHK- Y14;应用LipofectamineTM 2000将上述重组质粒成功转染至人乳腺癌细胞内,转染效率高达90%。RT-PCR检测显示Y14基因在mRNA转录水平被显著抑制,pshRNA1- Y14和pshRNA2- Y14分别抑制到正常细胞的24.16%和29.72%。Western Blot检测结果与RT-PCR相似,pshRNA1- Y14和pshRNA2- Y14分别将Y14蛋白抑制到正常细胞的20.63%和27.56%,pshRNA1- Y14干扰效果较好。结论重组质粒pshRNA1- Y14、pshRNA2- Y14均能有效抑制人乳腺癌细胞Y14蛋白的表达,以pshRNA1- Y14干扰效果最好。第五部分Y14蛋白shRNA及依米丁对人乳腺癌细胞作用的蛋白组学研究目的寻找Y14蛋白shRNA及依米丁对人乳腺癌细胞作用后的蛋白差异位点。方法应用干扰效果较好的重组Y14shRNA质粒转染及依米丁处理人乳腺癌细胞MDA-MB-231和MCF-7,应用双向凝胶电泳技术寻找分析Y14蛋白干扰及依米丁处理后的蛋白差异位点。结果结果显示:在人乳腺癌MDA-MB-231细胞中依米丁处理组与对照组相比有25个蛋白差异位点,pshRNA1- Y14处理组与对照组相比有21个蛋白差异位点。同ER(-)的人乳腺癌MDA-MB-231相比,pshRNA1- Y14和依米丁处理的ER(+)的人乳腺癌MCF-7细胞中还存在13个不同的蛋白差异位点。结论应用双向凝胶电泳技术可寻找分析出pshRNA1- Y14及依米丁处理人乳腺癌细胞MDA-MB-231和MCF-7后的蛋白差异位点。