研究背景:关于高等脊椎动物在出生后是否存在卵巢干细胞补充原始卵泡的问题争论了近百年。近年来的研究证实，雌性哺乳动物在出生后仍具备生产生殖细胞的能力，即在出生后的哺乳动物卵巢内存在一定数量的卵巢生殖干细胞(OGSCs)或雌性生殖干细胞(FGSCs)。这类生殖干细胞一般认为定位于卵巢表面上皮(OSE)，在雌性哺乳动物的整个生殖周期，OGSCs可通过增殖和分化不断地提供卵母细胞补充原始卵泡池，减缓卵泡池的消耗及耗竭。故而，探讨OGSCs增殖和分化的调控机理，能为进一步了解卵巢的功能提供新的思路，为治疗卵巢功能早衰和不孕症提供新策略。　　虽然出生后哺乳动物卵巢内存在OGSCs，但其数量的多少，具体的定位，增殖能力的大小都有待进一步阐明。尤其是，随着生殖年龄的增加，OGSCs的数量及增殖能力如何改变，调控OGSCs的增殖及分化的分子机制是什么，都需要深入去研究。　　作为经典的信号通路之一，Notch信号通路主要调控细胞的增殖和分化，在细胞发育和细胞命运决定中发挥重要作用。在调控干细胞方面，Notch信号通路主要功能表现为：维持干细胞的持续更新，调节干细胞的分化等。通过对非脊椎动物果蝇的研究发现，Notch信号通路参与了果蝇卵巢干细胞的形成，能促进卵巢干细胞的增殖并阻止其分化。此外，在果蝇中还发现，卵巢干细胞的增殖能力随着年龄的增加而减弱，有趣的是，同时Notch信号活性也出现下降现象，当增加Notch信号活性时卵巢干细胞的寿命也相应增加。因此，Notch信号通路对干细胞，特别是果蝇卵巢干细胞的增殖、分化具有重要的调控作用。在小鼠卵巢中，Notch信号分子被发现参与了原始卵泡的形成，揭示Notch信号通路也调控着哺乳动物卵巢的功能。然后，Notch信号通路是否调控小鼠OGSCs的增殖和分化，两者之间有何关联却未见报道。　　第一部分小鼠OSE内OGSCs的增殖能力随着生殖年龄的改变及与Notch信号通路相关性的研究　　目的：OGSCs被认为主要定位于小鼠OSE，本研究主要阐明OGSCs的增殖能力与小鼠卵巢生殖年龄变化的关系，以及这种变化与Notch信号通路活性改变的相关关系。　　方法：　　1.动物实验小鼠：各生殖年龄阶段昆明雌性小鼠常规状态下自由饮食，实验小鼠经南昌大学动物与伦理委员会批准。　　2. Real time PCR及Western blot检测：分别摘取3D、2M、12M、20M四个年龄阶段的卵巢，采用细胞刷，在体视显微镜下尽可能收集各年龄段卵巢表面上皮组织及细胞，提取总RNA及总蛋白，Real time PCR及Western blot检测在小鼠OSE中生殖干细胞标志分子Mvh、Oct4，Notch信号通路重要分子Notch1、关键靶分子Hes1、Hes5在各生殖年龄阶段的表达水平改变情况。　　3. HE染色及免疫组织化学检测：分别摘取3D、2M、20M三种年龄阶段的卵巢，尽可能去除干净卵巢附件，采用4％的甲醛液固定过夜，常规HE染色及免疫组织化学检测Mvh、Oct4、Notch1、Hes1及Hes5在不同生殖年龄阶段小鼠OSE中的表达水平情况。　　4.组织双免疫荧光检测：摘取小鼠3D、2M、20M的卵巢，石蜡切片脱蜡后经抗原修复、血清封闭等操作后，双免疫荧光检测Mvh/Notch1、Mvh/Hes1及Mvh/BrdU在各年龄阶段小鼠OSE共表达情况。　　5.数据处理及统计学分析：所有数据采用SPSS18.0软件包行统计学分析。计量资料以均数?标准差( x?s)，行方差分析；组间比较采用t检验。结果以P?0.05差异具有统计学意义，P?0.01及P?0.001具有极度统计学意义。　　结果：　　1.生殖干细胞标志基因及Notch信号通路关键分子在OSE的表达趋势：Real time PCR和Western blot检测结果显示，Mvh及Oct4的mRNA和蛋白水平在3D龄OSE表达最高，在2M龄OSE中表达极度下降，而在12M及20龄小鼠OSE中，几乎检测不到两种标志基因的的mRNA和蛋白表达(P?0.05)。Notch信号通路重要组分Notch1、Hes1、Hes5在四种不同生殖年龄阶段均有表达，都表现为随着生殖年龄的增加而下降。然而，与Mvh及Oct4相比较，Notch信号通路组分仍表达于12M和20M龄小鼠OSE。　　2. HE染色及IHC检测生殖干细胞标志基因及Notch信号通路关键分子在OSE中的表达：HE染色结果显示3D及2M小鼠的OSE较为完整，细胞排列较为紧密，胞核蓝胞浆红，但20M时OSE表面不完整，细胞排列较松。IHC结果显示，Mvh和Oct4在3D的OSE表达最高，2M的OSE表达水平相对较高，而到了20M后，OSE几乎找不到Mvh和Oct4阳性细胞。此外，检测了Notch信号组分的表达，结果显示Notch1、Hes1、Hes5在3D、2M及20M三种年龄阶段均有表达，与3D相比，上述三种信号分子在2M及20M小鼠OSE阳性表达均明显下降。　　3. OSE内生殖干细胞与Notch信号通路相关分子存在共表达：采用双免疫荧光检测生殖干细胞标志物和Notch组分在OSE内的共表达情况。结果显示，Mvh（绿色）和Notch1（红色）共表达于OSE内，且在3D小鼠OSE内表达最强，在2M小鼠OSE内表达强度下降明显，而在20M小鼠OSE内几乎未见表达。相似的共表达结果也出现在Mvh（绿色）与Hes1（红色）、Mvh（绿色）与BrdU（红色）之间。　　结论：　　1.出生后小鼠OSE内存在一定数量的OGSCs，其数量或增殖能力随着小鼠的生殖年龄增加而减弱，具体表现为在刚出生后的OSE内含相对较多的OGSCs，到性成熟年龄后仍保有一定数量的OGSCs，而到了老年后，OSE内几乎不再含有OGSCs。　　2. Notch信号通路相关分子表达于OSE内，其表达量随着小鼠生殖年龄增加而逐步下降。　　3.在OSE内，生殖干细胞标志物与Notch信号通路相关分子存在共表达现象，两者表达的变化趋势具有一致性，都随着生殖年龄的增加而表达减弱，表明OGSCs的增殖能力与Notch信号通路活性的改变存在一定的相关关系。　　第二部分调控Notch信号通路活性对小鼠OGSCs的增殖能力及卵泡发育的影响　　目的：本实验拟通过调控Notch通路活性，观察对OSE内OGSCs的增殖能力、原代OGGCs的增殖能力以及对卵泡发育的影响，进一步探讨Notch信号通路在调控OGSCs增殖中的作用。　　方法：　　1.离体卵巢的培养及不孕小鼠模型的构建：不同年龄段小鼠的卵巢，体视显微镜下剥离干净，预冷D-Hank’s液清洗后，放置在Transwell小室上培养，采用Waymonth培养液+10%FBS，放置于37℃，5%CO2孵箱培养。6-8W左右的雌性小鼠，采用白消安及环磷酰胺腹腔注射构建不孕模型。　　2.构建 Notch信号通路过表达慢病毒载体：根据小鼠Notch1(Genbank:NM_008714.3)的胞内段NICD序列(共2370bp)，以小鼠cDNA为模板，扩增N1ICD全长序列。采用慢病毒表达载体、pGag/Pol、pRev、pVSV-G四质粒共转染293T细胞，包装NICD过表达慢病毒颗粒，命名为LV-N1ICD，滴定测定后，感染293T细胞，验证效果后分装放置-80℃备用。　　3.原代分离、培养OGSCs：5-7d小鼠卵巢20个左右，体视显微镜下剥离干净，尽可以剪碎卵巢组织后，胶原酶及胰酶消化后，离心收集细胞沉淀，采用生殖细胞特异性标志物Mvh作为一抗，采用免疫磁珠分选的方法富集OGSCs，铺板于预先经丝裂霉素C处理的STO饲养层细胞上培养。　　4. Real time PCR及Western blot检测离体培养卵巢中Notch信号通路活性高/低表达后生殖干细胞标志分子Mvh、Oct4表达的改变：收集5-7d小鼠卵巢，随机分成四组：DMSO组、DAPT10μM组、DAPT20μM组和DAPT40μM组。采用特异性阻滞剂DAPT处理48h后，用细胞刷收集卵巢的OSE，提取总RNA及总蛋白质，Real time PCR及Western blot检测小鼠OSE中生殖干细胞标志分子Mvh、Oct4和Notch信号通路关键靶分子Hes1、Hes5的表达改变情况。收集5-7d小鼠卵巢，设置LV-Control组及LV-N1ICD组，体外培养感染48h，提取OSE总RNA，检测Mvh、Oct4、Hes1、Hes5等基因的表达水平改变情况。　　5. Real time PCR检测OGSCs中Notch信号通路活性高/低表达后生殖干细胞标志分子Mvh、Oct4表达的改变：传代OGSCs，设置DMSO组，DAPT10μM组；传代OGSCs细胞，设置LV-Control组及LV-N1ICD组，处理48h后，提取总RNA，检测Mvh、Oct4、Hes1、Hes5等基因的表达水平改变情况。　　6.细胞双免疫荧光检测：卡诺固定液固定细胞，常规细胞免疫荧光操作，加Mvh/Hes1、Mvh/Hey2及Mvh/Oct4一抗，分别检测生殖细胞标志物基因与Notch通路关键分子等共表达情况。　　7. HE染色及组织双免疫荧光检测Notch信号通路活性高/低表达后卵巢卵泡发育和Mvh/Oct4在OSE中表达情况：收集5-7d小鼠卵巢，随机分成三组：DMSO组、DAPT20μM组和DAPT40μM组。DAPT处理48h后，卵巢经4%多聚甲醛处理过夜，石蜡包埋后切片，采用HE染色观察整个卵巢卵泡发育情况；双免疫荧光检测Mvh/Oct4在OSE中表达改变情况。　　8.小鼠模型活体显微注射：6-8W正常雌性小鼠，设置DMSO组及DAPT组，麻醉后无菌条件下于背部剪开小鼠皮肤及肌肉，找到卵巢，行显微注射。6-8W不孕雌性小鼠模型，设置LV-Control组，LV-N1ICD组，同样的方法注射卵巢。注射后缝合小鼠肌肉及皮肤，自然条件下饲养。　　9. ELISA（间接法）检测小鼠血清FSH、P、E2浓度改变：小鼠活体显微注射DAPT及LV-N1ICD后，分别于注射后7D、14D，检测小鼠血清FSH、P、E2的浓度变化。　　10.与野生雄性小鼠的合笼：小鼠活体显微注射DAPT及LV-N1ICD后，分别于合笼后20D、50D及80D后，计数产仔情况。　　11.免疫组织化学检测：第8步骤显微注射的小鼠，摘取卵巢，HE染色观察注射7D、14D后DAPT组、LV-N1ICD组的卵泡发育情况；免疫组织化学检测注射7D后DAPT组、LV-N1ICD组卵巢OSE内Mvh及Oct4表达情况。　　12.碱性磷酸酶活性检测：传代OGSCs细胞，设置DMSO组及DAPT10μM组；传代OGSCs细胞，设置LV-Control组及LV-N1ICD组。细胞培养48h后，4%多聚甲醛固定，染色液覆盖细胞染色，光学显微镜下观察结果。　　结果：　　1.成功构建LV-N1ICD：包装好的LV-N1ICD，感染293T细胞48h后，经qPCR、Western blot检测Notch信号通路靶基因Hes1、Hes5的表达。与对照组LV-Control组相比，靶基因Hes1、Hes5的mRNA及蛋白质表达水平明显升高，证实LV-N1ICD能有效激活Notch信号通路活性。　　2.原代分离并培养生殖干细胞：分离到的细胞为卵圆形，直径小于20μm，经生殖干细胞标志基因Reat time PCR，碱性磷酸酶活性、细胞双免疫荧光检测显示，此细胞系表现出OGSCs的特性，表明分离到的细胞即为OGSCs。　　3. Notch信号与生殖干细胞标志物在OGSCs内共表达：Dual-IF检测结果显示， Mvh/Hes1、Mvh/Hey2在OGSCs内存在共表达现象。　　4.抑制Notch通路活性降低了OSE内生殖干细胞标志基因的表达：Real time PCR和Western blot结果显示，OSE内生殖干细胞标志物Mvh和Oct4的mRNA及蛋白表达水平随着DAPT浓度的增加而下降；同时伴有Notch通路靶分子Hes1、Hes5随着DAPT浓度的增加而下降。　　5.抑制Notch信号活性减少了卵泡数量：5-7d小鼠卵巢DMSO组、DAPT20μM组和DAPT40μM组处理48h后，HE染色结果显示，20μM组原始卵泡数量减少明显，40μM组进一步出现减少。另外，采用DAPT体内显微注射6-8w小鼠卵巢，HE染色结果显示，卵巢的卵泡数量出现减少；　　6. LV-N1ICD感染卵巢：5-7d小鼠卵巢体外感染LV-N1ICD后，OSE内Mvh和Oct4的mRNA表达水平上调不明显；不孕小鼠模型体内注射后14D，HE染色可见卵泡样结构。　　7.小鼠血清FSH、P、E2浓度改变：DAPT组的FSH、P浓度改变没有统计学意义，但E2的浓度出现了降低。LV-N1ICD组的FSH、P、E2浓度改变没有统计学意义。　　8. DAPT显微注射小鼠卵巢降低了产仔数量：与DMSO组比较，2个DAPT组产仔的数量都出现明显下降。然而，对于不孕小鼠模型，与LV-Control组一样，2个LV-N1ICD组与野生雄鼠合笼后均未产仔。　　9.抑制Notch信号降低了OSE内生殖干细胞的活性：5-7d小鼠卵巢分为DMSO组、DAPT20μM组和DAPT40μM组，DAPT体外培养48h后，组织Dual-IF检测显示，在OSE内Mvh、Oct4的表达水平随DAPT浓度的增加而下降。　　10. IHC检测结果：显微注射正常小鼠卵巢7D后，与DMSO组相比，DAPT组的卵巢OSE内Mvh及Oct4表达水平下降；与LV-Control组相比，LV-N1ICD组卵巢OSE内Mvh及Oct4表达没有明显变化。　　11.抑制/活化Notch信号活性后，OGSCs内Mvh、Oct4、Hes1、Hes5等基因的表达水平降低/升高：DAPT处理OGSCs48h后，Mvh、Oct4标志基因的表达水平明显降低，LV-N1ICD处理OGSCs48h后，Mvh、Oct4的mRNA表达水平有一定程度的上升；此外Hes1、Hes5的mRNA表达水平也出现相应的下降和上升。　　12.抑制/活化Notch信号活性后，OGSCs内碱性磷酸酶活性降低/升高：OGSCs分别用DAPT和LV-N1ICD处理48h后，ALP检测结果显示，与对照组相比，DAPT组ALP活性出现下降，LV-N1ICD组ALP活性出现上升。　　结论：　　1.成功构建并包装LV-N1ICD，能够有效激活Notch信号通路。　　2.成功原代分离培养出OGSCs，在体外培养，并能维持生殖干细胞特性。　　3. Notch信号组分与生殖干细胞标志物共表达于OGSCs内，改变Notch活性后，OGSCs内ALP活性发生改变，证实Notch信号通路与OGSCs的活性具有相关性。　　4. Notch信号调控着OSE内生殖干细胞的活性，并调控卵巢原始卵泡的数量，激活Notch通路对恢复不孕小鼠模型的卵子再生作用有待进一步验证。　　5.实验结果证实了OGSCs的增殖能力与Notch信号通路之间存在相关性，Notch通路有可能是调控OGSCs增殖能力的关键通路之一。