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第一部分:LMO2短剪接模式LMO2-c的功能初探原癌基因LMO2(也称Ttg-2或Rbtn2)定位于人类11号染色体短臂1区3带(11p13),最早是从带有染色体易位t(11;14)(p13;q11)的急性T淋巴细胞白血病(T-ALL)患者病变细胞的染色体断裂点处克隆得到的。该基因隶属于一类仅含两个LIM结构域而几乎不含有其他成分的蛋白家族,因而由LIM only缩写得名。LMO2基因对红系细胞和T淋巴系细胞的分化都具有重要的作用：敲除LMO2基因的小鼠在胚胎期卵黄囊血岛不能正常发生,造成胚胎期约10.5天时死亡。LMO2基因的过表达可以导致急性T淋巴细胞白血病的发生,近期报道了2例X连锁重症合并免疫缺陷病(X-SCID)患儿在基因治疗后发生了不可控的白血病样T淋巴细胞增殖,进一步检查证实这一现象是由治疗载体插入LMO2基因上游导致LMO2基因的异常表达所致。先前的实验中,我们利用5RACE技术从成人肾组织mRNA中克隆到LMO2的另一种剪切模式(LMO2-c),它编码一个与原LMO2的N端序列不同的蛋白质,比LMO2少7个氨基酸,但保留了特征性的LIM结构域。这个新蛋白的功能未知。
本研究旨在初步探讨LMO2-c可能的生物学功能,主要进行了以下几个方面的工作：(1)通过在真核细胞中表达LMO2-c与增强型绿色荧光蛋白(EGFP)的融合蛋白观察其细胞定位,我们发现与LMO2不同,LMO2-c主要呈点状聚集在细胞核的两端。(2)比较了不同蛋白标签(主要为谷胱甘肽S转移酶标签和麦芽糖结合蛋白标签)对LMO2融合蛋白沉淀技术的影响,发现MBP标签在提高探针蛋白的可溶性的同时并未影响LMO2与已知蛋白间的相互作用。(3)通过基于MBP标签的融合蛋白沉淀技术和哺乳动物双杂交系统检测LMO2-c与LMO2的转录协同因子(GATA-1、LDB1)的相互作用,证实了LMO2-c能与K562细胞中内源性的GATA-1、LDB1蛋白特异的结合。(4)通过哺乳动物双杂交实验发现了LMO2-c和LMO2可以竞争性地结合LDB1。据此我们推测LMO2-c可能通过竞争性结合GATA-1、LDB1等转录因子从而拮抗LMO2功能。
第二部分:LMO2复合物抑制microRNA-142转录的机制研究microRNA(miRNA)是近几年新发现的一类内源非编码的单链小分子RNA,这种小分子RNA通过与靶mRNA的互补配对而在转录后水平上对基因表达进行负调控,导致靶mRNA的降解或翻译抑制。越来越多的研究证据表明microRNA在正常的造血过程中发挥了重要作用,并与血液系统肿瘤的发生、发展密切相关。但是对于血细胞生成过程中microRNA的表达和调控机制还知之甚少。只有miR-223最近被证实作为C/EBPα和NFI-A的靶分子在骨髓细胞分化过程中发挥重要作用,而同样能促进T淋巴细胞分化的miR-142的表达调控机制尚未见报道。
本实验室通过前期的生物信息学检测发现,在miR-142基因组序列上游1.9kb处存在一个典型的LMO2复合物(LMO2、LDB1、GATA1、TAL1、E47)结合序列,而LMO2复合物又是特异调控造血发育的转录复合物,因此本部分实验旨在探讨LMO2复合物调控miR-142转录的分子机制。本文通过应用启动子活性分析、过表达、RNA干扰等分子生物学手段对miR-142基因的表达调控方式进行了研究,证实了LMO2参与形成的复合物能够抑制miR-142启动子的转录和内源性miR-142的表达。利用染色质免疫沉淀技术(ChIP)进一步证实了细胞内源性的LMO2能够结合于miR-142启动子序列的相应LMO2复合物结合位点。
本研究所发现的LMO2复合物抑制miR-142转录的机制有非常重要的意义：(1)目前已知的受LMO2复合物调控的基因有Runnx1、c-kit以及红系特异性基因GPA和p4.2等,相比对前几者的正调控作用,miR-142基因是第一个能够被LMO2复合物负调控的下游靶基因,该发现显示了LMO2复合物具有转录的双向调节功能。(2)更为重要的是,鉴于miR-142基因是迄今为止唯一一个已知和T细胞发育相关的LMO2下游靶基因,这个发现为研究LMO2在早期T细胞发育中的作用方式以及在白血病发生中的重要作用提供了新的线索,并为白血病的诊断与治疗提供了新的思路和方法。