研究背景神经系统发育是机体发育的重要组成部分。研究神经系统的发育，对于深入研究神经细胞的增殖、分化，以及寻求调控与干预细胞的增殖、分化作用的新靶点，具有广泛而深远的意义。活性氧（ROS）作为一类重要的信号分子，在机体其它组织（如肝组织）的发育过程中扮演重要的角色。本实验类比ROS对肝细胞增殖调控的研究，探索ROS在神经系统发育中的作用，以及ROS对脑细胞增殖调控的信号作用及机制。实验目的通过研究大鼠不同发育时期脑组织氧化还原动态平衡的变化规律，探讨脑发育过程中ROS水平的变化与脑组织抗氧化系统活性变化的相互关系，提出ROS作为信号分子参与调控脑细胞增殖过程的假说。并以PC12细胞构建神经细胞体外研究模型，阐明ROS在调控神经细胞增殖中的作用及机制。为进一步寻求调控与干预细胞的增殖、分化作用的新靶点，提供实验依据。实验方法和研究方案1.检测SD大鼠不同发育阶段脑组织氧化还原动态平衡的变化规律，并初步研究ROS对神经细胞增殖的调控。（1）培养不同发育阶段的大鼠原代神经元，检测神经元的细胞周期、ROS水平以及PCNA、CyclinD、Rb等增殖蛋白表达的变化。（2）检测以Nrf2为核心的抗氧化酶谱的表达及活性的变化。（3）分离不同发育阶段大鼠脑组织，提取线粒体，检测线粒体活力及线粒体ROS水平的变化。2.体外实验研究ROS对PC12细胞增殖作用的量效关系，以及在细胞增殖过程中的信号调控作用。（1）构建神经细胞体外模型——PC12细胞培养模型。观察PC12细胞的生长特性，绘制生长曲线。（2）分别在PC12细胞培养的过程中给予氧化剂和抗氧化剂的处理，筛选适当的剂量范围，研究ROS水平与PC12细胞增殖作用的量效关系。（3）通过处理干预PC12细胞的细胞增殖过程，测定不同处理组细胞细胞周期蛋白CyclinD、PCNA、Rb等的表达，研究ROS在细胞增殖过程中的信号调控作用。实验结果1．SD大鼠出生后7-15天期间，大鼠脑组织快速发育，生长发育速率加快，代谢旺盛，呈现“突发性”的生长状态。同时，ROS的产生与抗氧化防御系统的活性处于一个活跃而又平衡的状态。2．在大鼠的脑发育过程中，线粒体活力的变化趋势与线粒体ROS的变化趋势相反。在P7~15天“脑突发生长期”线粒体代谢旺盛，线粒体活力出现短暂的升高，之后又逐渐回落。脑组织线粒体的活力是随着发育进程的推进而逐渐升高，线粒体的功能也逐渐完善。3．神经细胞内ROS参与调控细胞的增殖过程。在大鼠胚胎发育过程中，脑组织ROS水平由高变低，抗氧化防御系统功能则由低变高，说明ROS水平的变化与神经细胞增殖和分化成熟有重要作用。从大鼠胚胎发育早期一直到大鼠出生后发育成熟，脑组织的氧化还原维持着动态平衡，ROS的水平被控制在“合适”的范围。在脑组织中核心的转录因子Nrf2有序地调控或部分调控以ROS存在水平为轴心的氧化还原动态变化；自由基清除酶SOD蛋白表达逐渐下降和抗氧化酶CAT、Gpx和GR等蛋白表达逐渐升高，共同维持稳定的氧化还原的动态平衡。由此可见，大鼠发育过程中脑组织的氧化还原状态调节ROS的水平，而ROS的水平又参与调控神经系统的发育。4．使用氧化剂t-叔丁基过氧化氢（t-BHP）和抗氧化剂N-乙酰半胱氨酸（NAC）分别处理对数生长期的PC12细胞。t-BHP处理PC12细胞，表现出明显的剂量–效应关系，适当剂量的t-BHP（1μM）可以通过激活ERK通路促进细胞增殖。NAC可以显著降低细胞ROS水平，并通过激活p38信号通路一定程度地抑制细胞增殖。同时，使用p38抑制剂能够有效阻断NAC对细胞增殖的抑制作用。该结果说明，ROS水平的变化能够通过激活ERK或p38信号通路，促进或抑制PC12细胞的增殖。结论本课题从大鼠脑组织发育过程中ROS水平的变化与抗氧化防御系统的变化相矛盾这一现象，提出“大鼠发育过程中脑组织的氧化还原状态调节ROS的水平，而ROS的水平又参与调控神经系统的发育”的猜想。又通过体外实验研究进一步发现，分别给予PC12细胞氧化剂和抗氧化剂处理，发现细胞ROS水平的变化能够通过激活ERK或p38信号通路促进或抑制细胞增殖。从正反两个方面证明ROS作为重要信号分子参与PC12细胞的增殖调控。这为论证“ROS水平可以调控神经细胞的增殖状态”提供了坚实的依据，也为深入阐明ROS在神经系统发育过程中具体的作用机制提供新的思路和方向。