研究背景和目的原发性肝细胞癌(primary hepatocellular carcinoma, HCC)是我国最常见的并且是恶性程度最高的恶性肿瘤之一,是一种对人民健康产生严重威胁的恶性肿瘤。原发性肝细胞癌在亚洲具有有很高的发病率和死亡率。然而,最近晚期肝癌1年存活率仍不到50%。经导管肝动脉化学栓塞(transcatheter arterial chemoembolization, TACE)为肝癌非手术治疗的重要方法之一,经股动脉插入导管,将导管超选择地插入肝固有动脉或肿瘤供血分支,然后经导管注入栓塞剂和治疗药物,采用TACE可提高肿瘤局部的药物浓度,从而提高疗效,减少全身副作用。目前,TACE不仅作为不能切除肝癌的主要治疗手段,而且能应用于可切除的肝癌,有门脉癌栓肝癌,恶性肝转移瘤的治疗。放射治疗是通过发射高能的射线破坏肿瘤区域的细胞DNA,造成细胞凋亡来杀伤肿瘤细胞。放射治疗作为肝癌综合治疗的重要手段,主要适用于不能手术切除的患者,可以治疗肝脏肿瘤及远处转移灶,但近年来由于放疗技术的发展,肝癌的放射治疗应用逐渐增多。三维适形放疗及调强放疗是采用三维适形治疗或调强计划系统进行聚焦式照射,达到精确定位、精确计算和精确治疗。正常肝脏对辐射较敏感,肝癌肿瘤与低分化鳞癌有相似的放射敏感性,其放射敏感性在人体中仅次于骨髓、淋巴组织和肾脏。VX2瘤株起源于Shope病毒诱发的兔乳头状瘤衍生的鳞癌,在兔动物体内缺乏该肿瘤的抗体,可接种到动物兔肝脏、肾脏、肌肉、肺脏等部位,制成兔原位肿瘤动物模型。VX2兔肝肿瘤具有与人肝脏富血供肿瘤类似的血供特点,动脉血供丰富,它是在大型动物上建立的富血供肝肿瘤模型,是一种良好的肝肿瘤动物模型。VX2兔肝肿瘤适合行动脉化疗栓塞术、影像学、治疗学、抗肿瘤药物的代谢动力学的实验性研究。侵袭、转移是肿瘤恶性行为的最本质特征。细胞外基质(extracellularmatrix, ECM)是肿瘤细胞进行侵袭和迁移的第一道重要屏障。肿瘤细胞转移是一个极其复杂的过程,包括细胞粘附到ECM,蛋白酶分泌,ECM降解和肿瘤细胞迁移,其中重要的第一步是肿瘤细胞通过宿主细胞和ECM的屏障,穿越组织的边界。细胞分泌的蛋白酶比如纤溶酶原激活剂、丝氨酸蛋白酶、基质金属蛋白酶类(matrix metalloproteinases, MMPs)帮助肿瘤细胞实现这迁移过程。MMPs是一类分解细胞外基质、基底膜,与肿瘤的侵袭转移关系十分密切的蛋白水解酶。目前许多研究证明,MMPs的过度表达与肿瘤的浸润和转移相关。在MMPs家族中,MMP-2 (72 kD gelatinase A)和MMP-9 (92 kD gelatinase B)是两个关键的成员,被认为在肝细胞癌侵袭、转移过程降解基质扮演着重要的角色。MMP-2、 MMP-9能降解层粘连蛋白、巢蛋白、明胶,MMP2还激活MMP-9、MMP-13,能降解I型胶原,MMPs共同作用可降解所有的细胞外基质。肝癌细胞的浸润和转移的过程中,必需发生其基底膜(basementmembrane, BM)的降解,BM呈厚实的网状结构,主要由糖蛋白、Ⅳ型胶原等组成,而Ⅳ型胶原又是BM的主要支架。丰富的资料研究表明,肿瘤细胞分泌的MMPs中的MMP-2、MMP-9其降解底物是Ⅳ胶原,使BM发生缺损,促使肿瘤细胞向周围组织浸润和转移。恶性肿瘤组织中MMP-2、MMP-9均有表达,尤其在肿瘤边缘表达最强,而癌周间质等癌旁正常组织却为弱表达或不表达。血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor, VEGF)促进肝癌细胞浸润和转移的机制主要有：(1)增加血管的通透性；(2)促进血管内皮细胞的增殖；(3)促进血管支持物的生成；(4)抑制肿瘤细胞的调亡；(5)激活了PI3K/AKT、FAK/paxillin、Shc/RAS/MAPK及PLC-IP3/DAG-PKC等信号传导通路；从而为恶性肿瘤的浸润、转移创造条件。既往的研究表明：放疗可能对肿瘤组织中MMP-2、MMP-9的表达有上调作用,MMP-2、MMP-9是促进肿瘤侵袭中的重要因素,推测放疗引发促进转移的重要机制之一或是上调了MMPs的表达,增强了它们的活性。辐射能激活了VEGF-MMP2通路,诱导P53的上调,使受照射的肝癌细胞和未受照射的肝癌细胞都增强了侵袭能力。通过PI3K/PTEN/AKT/mTOR途径,肝癌的侵袭和转移和MMP9的上调有关。既往研究发现,阻塞小鼠肝脏的动脉血流能引起短暂的血液灌注减少和转移相关的VEGF和MMP的基因的表达,血流灌注的减少和低氧可能引起VEGF表达的上调。在数个碘油栓塞治疗兔VX2肝癌的实验中,残留的癌细胞会出现了MMP-2、MMP-9及VEGF的高表达。有相当部分HCC患者会出现VEGF过表达,VEGF的表达与P53的表达及肿瘤复发率显著相关。TACE后残留的肝癌组织有丰富的血供,增加了VEGF的表达。总之,亚致死剂量放射线辐照肝癌细胞后会导致MMP-2、MMP-9、VEGF表达增强,与肿瘤进展和不良预后有关。肝动脉栓塞／阻塞治疗动物的肝肿瘤动物模型的实验中,亦出现了肿瘤区的MMP-2、MMP-9、VEGF的表达有升高。本研究在建立兔VX2肝癌模型的基础上,探讨VX2兔肝肿瘤放疗、兔肝碘油介入栓塞治疗和放疗联合介入治疗,对VX2兔肝肿瘤MMP-2、MMP-9、VEGF表达的影响。方法1.实验性动物模型制备将液氮内冻存VX2瘤株37。C水浴箱内复苏后,取细胞悬液置传代培养,台盼蓝染色后计算出细胞活率,按1×107/ml活细胞密度调制培养液。于兔后腿外侧肌肉内接种0.5m1培养液,兔后腿外侧肌肉内2周后产生一个约1cm3实质性的肿物,证明荷瘤兔已经制作成功。在2-4周左右进行传代,用25mg/kg1%戊巴比妥钠耳源静脉麻醉,在无菌条件下手术取出荷瘤兔后腿肌肉内种植的肿瘤,剖开瘤体后取灰白色质硬脆的瘤细胞生长活跃的组织部分,制成约1mm×1mm ×1mm大小的肿瘤组织块备用。将实验大白兔麻醉后,铺无菌巾,无菌条件下逐层开腹,暴露肝脏,以眼科剪于肝左中央叶表面剪开肝组织并形成开口小“烧瓶”样窦道,在实验兔肝内,直接植入2-3块已制作好的1mm3左右的瘤块,并以小块的明胶海绵填塞封闭窦口。仔细检查无活动性出血后回纳复位肝脏,逐层关闭腹腔、缝合皮肤。接种2-3周后用二维超声检测瘤体至1.5 cm左右时,可供以下实验使用。2.动物分组随机将实验大白兔分成A、B、C、D四组,每组10只。使用碘油1ml对每只兔肝VX2移植瘤进行栓塞治疗。A组为对照组；B组为单纯碘油栓塞；C为单纯放疗组；D组为先碘油栓塞介入治疗后联合放疗组；A、B、D组接种2-3周后进行介入治疗,C组接种2-3周后进行放射治疗,D组介入治疗后1周后进行放射治疗。实验大白兔完成治疗后1周处死,取出肝脏标本。3.放射治疗接受放疗的模型兔经将大白兔用25 mg/kg 1%戊巴比妥钠耳源静脉麻醉后,在木板体模上固定四肢及头部,大白兔身上安装定位标记,CT扫描范围自胸廓至整个腹部水平,层厚2.5 mm,通过数字显示屏查看肿瘤种植的肝脏部位。在大白兔耳源静脉注入碘帕醇10 ml,再次CT扫描。扫描后的CT图像通过数字化形式的局域网传输到三维适形治疗计划系统,对图像进行三维重建后采用三维治疗(Three dimensional conformal RT,3D-CRT)计划系统设计放射治疗计划。放射治疗计划在三维治疗计划系统中设计,大体肿瘤体积(GTV)加上8 mm摆位误差和肿瘤的运动范围,成为计划照射体积(PTV)。勾画体表轮廓和正常肝组织等重要脏器。剂量参考点位于肿瘤内,经剂量体积直方图(dose volume histogram, DVH)和等剂量线参考综合评价优化治疗计划,90%的等剂量曲线覆盖PTV。选择瓦里安直线加速器(23EX, Varian Medical Systmes, Palo Alto,USA, dose rate of 4Gy/min)放疗,6MeV或9MeV电子线,处方剂量为单次剂量15Gy。4.介入治疗将实验兔全麻后,腹部朝上,固定于手术台上,备皮、常规手术范围消毒、铺无菌巾。根据腹股沟区血管走向触摸股动脉搏动,确定股动脉位置,纵行切开皮肤,暴露出兔股动脉鞘,股动脉鞘内可见并行排列的股静脉、股动脉和股神经,直径由粗到细。把股动脉从股神经与股静脉中钝性分离出3cm,用4号手术丝线各1根分别穿上已经分离的股动脉近段和远段,结扎远端并提起近段,于暴露的股动脉中间段用眼科剪剪开一斜行切口,见有鲜红色血液喷出,将导管鞘经切口缓缓插人股动脉近端,动脉外留管鞘2厘米,用近端丝线将管鞘与股动脉固定,置入3F微导管和导丝。导管经股动脉、髂动脉进入腹主动脉,第一腰椎水平主动脉处注入造影剂,了解肝动脉走行及腹腔动脉开口位置。沿着微导管置入“J”型导丝于T12-L1之间,导丝头端朝前,如已到达腹腔动脉开口,导丝会头端形态改变或直接嵌入开口,导管探入腹腔干,注入造影剂,继续跟进导丝达肝总动脉处,再次注入造影剂,观察肝动脉走行显示肿瘤血供情况,根据造影情况进行肿瘤血供动脉的超选择插管。行DSA造影检查后分别注入药物进行介入治疗。5. MMPs和VEGF在VX2兔肝肿瘤的表达研究切取后的肿瘤组织经HE染色,光学显微镜观察。应用免疫组织化学、定量PCR、Western blotting检测MMP-2,9和VEGF表达水平。统计学处理应用SPSS16.0软件进行统计学分析,计量资料以均数±标准差(x±s)表示, 两组间比较采用独立样本Bonferroni检验；单因素多组间比较,采用单因素方差分析(one-way ANOVA);以P<0.05为差异有统计学意义。结果1.VX2兔肝肿瘤组织经HE染色后光学显微镜观察到：未经治疗的肿瘤组织内包括光亮和较大细胞核VX2细胞,在各治疗组中均可见存活的VX2细胞,炎症细胞浸润和坏死。坏死区域和未经治疗的肿瘤组织不一样,质地较硬,颜色苍白。经过放射治疗,具有活性的肿瘤细胞的数量减少,部分VX2细胞被纤维组织取代。经肝动脉导管碘油栓塞后,碘油主要是沉积在肿瘤的边缘,只有少数碘油进入缺乏血管的肿瘤中央地区。2.免疫组织化学染色显示,VEGF、MMP-2和MMP-9均在各组的肿瘤组织中表达。他们主要表达于肿瘤细胞的细胞质中。采用Image-Pro Plus 6.0图像分析系统,行VEGF, MMP-2和MMP-9蛋白的定量评估,选取阳性区域测定灰度值。在B、C和D组中,VEGF、MMP-2和MMP-9相比A组显著增加(p<0.05)。然而,VEGF和MMP-2、9的含量在B、C和D组之间没有显著差异(p>0.05)。免疫印迹分析(Western-blot)也用于检钡VEGF、MMP-2、MMP-9的表达,B、C和D组VEGF、MMP-2和MMP-9的表达对比A组也有所增加。我们通过实时PCR比较了残余肿瘤细胞中VEGF、MMP-2和MMP-9的nRNA转录水平,根据比较Ct值定量实时PCR的结果,治疗组(B、C、D组)和A组之间比较：VEGF、MMP-2和MMP-9的nRNA转录水平差异有统计学意义(p<0.05),但B、C和D组之间差异没有统计学意义(p>0.05)。结论VEGF、MMP-2和MMP-9在残留的肿瘤细胞的表达：介入组、放疗组和介入加放疗组与对照组相比有明显增加,介入加放疗组中VEGF、MMP-2和MMP-9的表达对比单一治疗组(介入组、放疗组)略减少,然而各治疗组间没有明显差异。