论文部分内容阅读
棉花是一种优良的天然纤维，为重要的纺织工业原料。棉纤维是由单个表皮细胞分化而来的，在棉纤维发育过程中合成的纤维素、非纤维素与多糖共同参与着纤维形态的建成。因此明确棉花纤维发育相关基因功能不仅具有生产意义，而且有助于阐明单细胞发育以及纤维素合成分子机理。本文对本研究室前期克隆的2个棉纤维发育相关基因构建了植物表达的RNAi干扰载体和过量表达载体，通过农杆菌介导法进行转基因棉花研究，以阐明相关基因功能。
首先利用已克隆的一个与拟南芥KORRIGAN基因（编码跨膜内切-1，4-β-葡聚糖酶）高度同源的棉花基因GhCEL，构建了该基因的RNAi干扰载体和过量表达载体，在前人研究获得部分转基因T0代植株的基础上，进一步进行不同转基因克隆系的创建和鉴定工作。经过PCR、潮霉素抗性检测，共获得转RNAi载体9个克隆的15个阳性T0代单株的种子，目前有3个克隆已经纯合。获得转正义表达载体5个克隆系的7个阳性单株T0代种子。Southern杂交表明，转RNAi载体的外源标记基因HPT已经整合进棉花基因组中，其中3个纯系都以单拷贝形式插入。纤维素含量的测定表明，转RNAi载体的3个纯合株系其成熟纤维的纤维素含量有了显著的提高，其原因是否因为GhCEL基因受到干扰还需进一步验证。棉纤维品质检测结果表明，与对照相比，转RNAi载体纯合株系060427-6-3的棉花纤维长度显著变长、比强度显著增强、马克隆值显著减小、伸长率显著减少。而其它纯系纤维长度却显著变短，其它指标没有发生变化，其原因需要进一步探讨。同时建立了一种简便、快速选择抗潮霉素转基因纯系后代的方法，Hyg浓度为20ppm可以很容易区别转基因阳性和非转基因后代。
利用我实验室前期克隆的棉纤维优势表达基因棉花2，5-二羟基苯乙酸1，2-加双氧酶基因（GhHGD）构建了由纤维特异启动子E6驱动的RNAi表达载体，通过农杆菌介导法将该表达载体转入高频再生品系WC中，对再生植株小苗进行标记基因nptⅡ的PCR检测，在检测的89株转基因小苗中，nptⅡ阳性植株共有81株，阳性率达到了91％。目前，总共收到转RNAi载体的4个克隆7个单株的种子。以nptⅡ基因作为探针，随机取转基因的T0代6株PCR阳性植株做Southern杂交，结果表明RNAi载体成功导入棉花基因组中。对T0代转基因棉花纤维的长度测定发现，T0代棉纤维长度比对照明显减少。下一步将通过创造转基因纯系进一步明确该基因的功能。