【背景】缺血再灌注损伤(Ischemia reperfusion injury IRI)是指组织器官缺血后再灌注不仅不能改善组织器官功能恢复,反而加重组织器官的功能障碍和结构损伤。在心肌缺血、脑卒中、创伤等疾病病理过程中都可发生IRI。肝脏IRI是肝脏外科最常见的病理过程,多见于休克、需要阻断肝脏血流的肝外科手术以及肝移植术等病理生理过程中,研究证实有10%的早期肝移植失败都是由于IRI造成,也是引起肝移植术后急慢性排斥反应的重要因素。目前关于肝脏IRI机制的研究将该病理过程分为两个阶段,早期,多为再灌注后6 h以内,以氧化应激产生大量活性氧族(Reactive oxygen species ROS)直接损伤肝细胞引起肝细胞凋亡坏死为主要特征;后期,以炎细胞浸润释放大量炎症相关因子,进一步放大炎症反应,直接或间接引起肝脏细胞凋亡坏死为特征。经典Notch信号途径在进化上高度保守,研究证实Notch信号途径广泛参与细胞增殖、细胞凋亡及细胞命运决定。在哺乳动物,经典Notch信号通路由5种配体(Jagged1, 2, and Delta-like [Dll] 1, 3,and 4)和4种受体(Notch1-4)组成,当配体与受体结合,Notch信号被激活,在??分泌酶(GSI)的酶切作用下,受体胞内段?(Notch intracellular domain NICD)被剪切,入核,与核内转录因子?RBP-J (recombination signal binding protein J?)?结合,启动下游基因如包括Hes家族在内的碱性螺旋环螺旋因子的表达,进而引发后续分子事件。近年有报道证实,Notch信号参与了细胞对于外界刺激的应答,在心、脑缺血性损伤中都有Notch信号途径的参与。Notch信号是否参与肝脏IRI过程?Notch信号在肝脏IRI中的作用如何?Notch信号在肝脏IRI中发挥作用的分子机制是什么?这些问题的阐明将为IRI相关的研究开辟新的领域,进一步完善肝脏IRI分子调控理论体系,为肝脏IRI的预防和治疗提供理论基础。【目的】研究Notch信号通路在肝脏IRI中的作用,作用的细胞生物学基础及分子机制,探索肝脏IRI新的分子调控机制,为肝脏IRI的预防和治疗提供新的理论依据。【方法】1.以无创动脉夹夹闭小鼠肝脏左叶、中叶血供90 min,制造小鼠肝脏IRI模型,利用Real-time PCR检测Notch信号通路相关分子在肝脏IRI中的表达变化,利用Western blot检测Notch1受体胞内段的表达水平。2.利用PCR方法鉴定小鼠基因型,获得Mx-Cre-RBP-Jf/f纯合子小鼠及Mx-Cre-RBP-Jf/+杂合子对照小鼠,PolyI-PolyC诱导,在纯合子小鼠中剔除RBP-J基因,实现阻断Notch信号。通过检测血清ALT、AST水平,组织学HE染色,TUNEL凋亡染色,MPO免疫组织化学,流式细胞仪检测相关炎性细胞浸润情况,Real-time PCR检测炎症因子表达水平,观察阻断Notch信号对肝脏IRI的影响。3.通过分别将RBP-J剔除和对照小鼠全骨髓细胞移植给致死剂量照射的野生型小鼠,获得在骨髓细胞特异剔除RBP-J小鼠及对照小鼠,行肝脏IRI造模,通过血清ALT、AST检测、组织学HE染色、TUNEL凋亡染色,观察骨髓细胞阻断Notch信号对肝脏IRI的影响。4.体外应用GSI阻断Notch信号,利用肝细胞体外缺氧(0.5%)培养15 h,正常培养基常氧培养6 h,模拟IRI,通过TUNEL凋亡染色,Casepase3 mRNA水平检,损伤后剩余活细胞计数,条件培养基刺激巨噬细胞后Elisa检测TNFα水平,观察肝细胞阻断Notch信号对IRI的影响。5.利用DCFH-DA探针结合流式细胞技术检测细胞内ROS水平,利用Real-time PCR检测iNOS、抗凋亡蛋白Bcl-xl mRNA表达水平,Western blot检测iNOS蛋白表达水平,观察阻断Notch信号对肝脏IRI肝细胞内ROS水平的影响,并利用ROS清除剂观察ROS在Notch信号调控肝脏IRI中的作用。6.利用Real-time PCR检测MnSOD mRNA表达水平,Western blot检测MnSOD、磷酸化STAT3、磷酸化Akt蛋白表达水平,利用免疫共沉淀检测Hes5与STAT3蛋白相互作用,通过过表达持续激活STAT3观察STAT3在Notch调控肝脏IRI中的作用,从而揭示Notch信号通路调控肝脏IRI中肝细胞ROS的分子机制。7.通过将肝细胞与过表达Notch配体Dll1 OP-9细胞共培养或过表达Hes5激活Notch信号,观察激活Notch信号对肝细胞IRI的影响。【结果】1.在肝脏IRI中伴随着Notch信号途径的广泛激活及下游分子的表达上调:在肝脏IRI中,Notch1、Notch2、Dll4、Jagged2、Hes5 mRNA表达上调、NICD蛋白表达明显上调。2.阻断Notch信号会导致肝脏IRI加重。表现为:血清ALT、AST水平升高;肝细胞凋亡、坏死增加;中性粒细胞、T细胞、巨噬细胞浸润增加,炎症因子TNFα、IL1β、IL6、IFNγ,趋化因子CCL3,粘附分子ICAM1产生增加。3.阻断Notch信号引起肝脏IRI中肝细胞细胞内ROS产生增加,并且,应用ROS清除剂可以挽救Notch信号阻断引起的血清ALT、AST升高,肝细胞凋亡坏死增加,说明Notch信号阻断引起肝细胞内ROS水平升高,最终导致IRI加重。4.进一步分子机制的研究证实:阻断Notch信号导致下游分子Hes5表达下调使得Hes5-STAT3复合物形成障碍,导致STAT3磷酸化水平下降,引起MnSOD表达下调,最终导致细胞内ROS水平升高,过表达持续激活STAT3可以上调MnSOD表达,降低细胞内ROS水平,挽救IRI中Notch信号阻断引起的细胞凋亡增加。5.体外配体激活Notch或过表达Hes5对肝细胞IRI起到保护性作用,表现为细胞内ROS水平下降,细胞凋亡减少。我们的研究结果说明,经典Notch信号途径通过其下游分子Hes5协助STAT3的激活,进而引起MnSOD表达上调,降低细胞内ROS水平,在IRI中对肝细胞起到保护性作用。【结论】1. Notch信号通路在肝脏IRI中发挥重要作用,Notch信号缺失会引起肝脏IRI加重。2.肝细胞是Notch信号调控肝脏IRI的细胞生物学基础,在骨髓细胞中阻断Notch信号对肝脏IRI无明显影响,肝细胞中阻断Notch信号引起IRI肝细胞凋亡增加。3. Notch信号通过调控肝脏IRI中肝细胞内ROS水平影响肝脏IRI,Notch信号缺失引起肝脏IRI中肝细胞ROS水平升高。4. Notch信号通过其下游分子Hes5影响STAT3的激活,进而调控MnSOD的表达,最终影响细胞内ROS水平,Notch信号缺失引起Hes5-STAT3复合物水平下降,MnSOD表达下调,ROS清除减少。5.体外激活肝细胞Notch信号对IRI起到保护性作用,激活肝细胞Notch信号引起IRI细胞凋亡减少。众多细胞、分子参与了肝脏IRI的调控,而我们的研究发现Notch信号途径通过Hes5影响STAT3的激活调控MnSOD的表达对肝脏IRI发挥保护性作用。我们首次报道了Notch-Hes5-STAT3-MnSOD分子调控轴,开辟了肝脏IRI分子调控机制研究的新的领域,为肝脏IRI的临床预防和治疗提供理论基础,同时也为众多ROS相关疾病,如:肿瘤、自身免疫性疾病的相关研究提供了新的思路。