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近年来,随着我国养牛业规模化、集约化养殖模式的不断发展,由此产生的牛粪等污染物越来越多。如果处理不当,将会导致空气、水体、土壤和病原微生物等方面的污染。牛粪中含有大量的纤维素和氮、磷、钾等营养元素,是一种具有很好发展前景的生物质资源。目前,牛粪无害化处理的主要技术是堆肥化技术,其能够实现牛粪污染物的无害化、资源化和减量化。堆肥化技术是指通过微生物自身代谢作用,促进畜禽粪便中可降解有机物质降解的一种技术,而高效降解牛粪微生物菌剂的研发有利于提高畜禽粪便的堆肥化效率。本研究利用16S rRNA基因高通量测序,分析牛粪堆肥化过程中菌群组成变化情况,了解堆肥化过程中优势菌群的变化情况;通过对牛粪堆肥不同阶段样品中产纤维素酶和蛋白酶细菌的分离筛选鉴定及酶活性测定,筛选出具有高效降解牛粪作用的优势菌种,为高效降解牛粪微生物菌剂的研发提供优势菌种。研究结果如下:1.对牛粪堆肥不同阶段的10个样品进行16S rRNA基因高通量测序,共得到1042384条原始序列,经优化过滤处理后得到386035条有效序列,所有有效序列归类为22个门、43个纲、96个目、202个科、366个属、515个种和777个OTU。在97%的相似水平下对样品的细菌群落Alpha多样性进行分析发现,在堆肥过程中细菌群落多样性呈先降低后升高最后趋于稳定的趋势。样品菌群组成结果显示,在门分类水平上,堆肥前期厚壁菌门、变形菌门、绿弯菌门和放线菌门的相对丰度较高,为主要的优势菌门;随着堆肥的进行,堆肥中后期的主要优势菌门为厚壁菌门、拟杆菌门、放线菌门、变形菌门和绿弯菌门。在科分类水平上,动球菌科、芽孢杆菌科、黄杆菌科、厌氧绳菌科和特吕珀菌科为堆肥过程中的主要优势科。在属分类水平上,堆肥过程中的优势菌属为芽孢八叠球菌属、特吕珀菌属、芽孢杆菌属、假纤细芽胞杆菌属、藤黄色杆菌属、马杜拉放线菌属、假单胞菌属、高温双岐菌属。2.通过纤维素刚果红培养基和酪素培养基,从牛粪堆肥样品中共分离纯化获得57株菌株,经菌落形态学观察、染色镜检、生化鉴定和16S rRNA基因PCR扩增鉴定,57株菌株中有56株为芽孢杆菌属细菌,1株为赖氨酸芽胞杆菌属细菌。57株菌株与所在属细菌的16S rRNA基因序列相似性均在98%以上。利用多重PCR进行进一步鉴定发现,菌株X10为解淀粉芽孢杆菌,菌株S15和FD2为枯草芽孢杆菌,18株菌株为短小芽孢杆菌。3.对分离纯化获得的57株菌株分别进行纤维素酶和蛋白酶酶活性初筛试验,筛选出10株纤维素酶和8株蛋白酶酶活性较高的菌株;分别通过CMC酶糖化力法和Folin(福林)试剂显色法对初筛所得菌株进行进一步的酶活性复筛试验,最终获得纤维素酶酶活力最高的菌株为X10,其酶活力为31.9U/mL;蛋白酶酶活力最高的菌株为S3,其酶活力为40.83U/mL。