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超氧化物歧化酶,简称SOD,是广泛存在于生物体的一种金属酶,能催化活性氧自由基发生歧化反应,在抗肿瘤、抗辐射、抗炎症等方面发挥着巨大作用。近年来,由于疯牛病等致病因子的传播,从动物血液中提取SOD的安全性受到严重的质疑。而植物来源的SOD分离纯化工艺还不太成熟,目前还没有得到普遍的工业生产。本文以收获期大蒜为原料,对大蒜SOD的提取条件、分离纯化工艺进行了优化研究,并先后利用DEAE Sepharose Fast Flow离子交换层析和Sephadex G-75凝胶过滤等方法纯化SOD;本文还对大蒜SOD部分酶学性质进行了相关研究,研究结果如下:
1.SOD酶活测定研究表明,被广泛采用的邻苯三酚自氧化法无法测定植物原料提取液中SOD的活性。因此,本文改用了NBT法作为SOD活性测定的依据。在硫酸铵分级沉淀实验中,该法与邻苯三酚自氧化法在测定趋势上具有一致性。
2.通过测试几种植物原料中SOD活性,确定以大蒜SOD提取对象,进而又研究了不同的提取液种类、浓度、固液比、抽提温度及抽提时间5个因素,并运用单因素结合正交试验设计对大蒜SOD的提取工艺进行了研究,得到最优的提取条件为:固液比1:12的0.03mol/L,pH=7.8磷酸缓冲液在25℃下抽提7h。在此条件下提取大蒜SOD其活性可达19.22U/ml,比活可达43.67U/mg。
3.对大蒜SOD分离工艺研究表明,大蒜SOD最佳分离方法为等电点沉淀法和硫酸铵分级沉淀法。其中等电点沉淀法酶活收率可达100%,纯化倍数为2.95;硫酸铵分级沉淀法酶活收率为92%,纯化倍数为3.66。
4.在大蒜SOD的精制方面,先后利用Sephadex G-75凝胶过滤和DEAE Sepharose FF离子交换层析等方法,获得了单一条带的纯物质。由SDS-PAGE电泳图谱计算得出SOD的分子量为40.58KDa。通过抑制性试验发现H2O2对SOD活力有强烈的抑制,而CHCl3-CH3CH2OH对其基本无抑制作用,表明大蒜SOD的类型可能为Cu/Zn-SOD。
5.对SOD部分酶学性质的研究表明,提纯后的SOD最适温度为50℃,具有较好的热稳定性,最适pH为5.0,在pH为5~8范围内,大蒜SOD的稳定性较好。