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目的:1.证明白细胞介素-37(interleukin-37, IL-37)在人体外周血CD4+CD25+调节性T细胞（regulatory T cells, Treg）中表达。2.研究CD4+CD25+Treg活化程度与表达IL-37的时效关系。3.证明IL-37的表达与CD4+CD25+Treg发挥免疫抑制效应有关。方法:第一部分：通过免疫磁珠分离技术，分离健康志愿者外周血中CD4+CD25+Treg细胞，应用流式细胞技术鉴定CD4+CD25+Treg细胞纯度。1.增殖活性检测：设置刺激剂组（每1×105个CD4+CD25+Treg细胞加入20μlDynabeads Human Treg Expender）、非刺激剂组、空白对照组（无细胞组），通过CCK-8法检测各组CD4+CD25+Treg细胞增殖活性，得出时效关系（24h、48h、72h）。2.IL-37表达情况检测：通过Western blot技术检测刺激剂作用下，不同时段（24h、48h、72h）IL-37表达水平的变化。3.IL-37表达位置检测：采用免疫荧光技术与激光共聚焦技术检测IL-37在Treg细胞内表达情况与表达位置。第二部分：通过免疫磁珠分离技术，分离健康志愿者外周血中CD4+CD25+Treg细胞和CD4+T细胞。通过siRNA技术沉默Treg细胞IL-37表达，分别设置siRNA-scramble干扰后Treg细胞组、正常Treg细胞组、siRNA-IL37干扰后Treg细胞组。1.SiRNA蛋白水平抑制效果检测：采用Western blot技术检测沉默效果。检测siRNA-scramble干扰后Treg细胞组、正常Treg细胞组、siRNA-IL37干扰后Treg细胞组在刺激剂作用72h时，IL-37表达情况。2.增殖活性检测：将CD4+CD25+Treg/CD4+CD25-T细胞共培养（按细胞计数1:1比例），另设空白对照组（CD4+CD25-T细胞）。分别设siRNA-scramble干扰后Treg细胞组、正常Treg细胞组、siRNA-IL37干扰后Treg细胞组。每1×105个CD4+CD25+Treg细胞加入20μl Dynabeads Human Treg Expender，采用CCK-8法检测各组CD4+CD25+Treg对CD4+CD25-T细胞的抑制效应。3.采用Elisa技术，检测不同时间CD4+CD25+Treg/CD4+CD25-T细胞组，空白对照组上清液中IL-2、IFN-γ/IL-4、IL-10、TGF-β水平的变化。结果：1.健康志愿者外周血单个核细胞（PBMCs）经过MACS两次分选，应用流式细胞仪检测得到CD4+CD25+Treg纯度达93%，CD4+CD25+Treg使用台盼蓝染色检测，细胞活性大于97%。2.应用Dynabeads Human Treg Expender对CD4+CD25+Treg细胞刺激激活。采用CCK-8验证其增殖效果良好，并在刺激达到72h时最为明显。3.通过Western blot检测，CD4+CD25+Treg细胞表达IL-37;在Dynabeads HumanTreg Expender作用（24h、48h、72h），CD4+CD25+Treg表达IL-37水平增高(P<0.05)。4.免疫荧光与激光共聚焦显示，CD4+CD25+Treg表达IL-37，并且在胞质和细胞膜附近表达量较多。5. CCK-8检测T淋巴细胞增殖活性实验中，SiRNA-IL-37干扰组与正常Treg共培养组、SiRNA-scramble干扰Treg组比较，OD450值存在明显升高（P<0.01），表明siRNA-IL-37干扰组Treg对CD4+CD25-T细胞抑制效应下降；siRNA-IL-37干扰Treg组与CD4+CD25-T细胞对照组相比较，OD450值无明显差异性（P>0.05），表明siRNA-IL-37干扰组对CD4+CD25-T细胞抑制效应微弱，与对照组无差异。6.流式细胞检测SiRNA-IL-37干扰Treg组与正常Treg细胞组在刺激剂作用24h，Foxp3、CTLA-4表达情况，结果显示SiRNA-IL-37干扰Treg组较正常组Foxp3、CTLA-4分子表达下降均明显（P<0.05），说明CD4+CD25+Treg细胞内IL-37的表达能够明显影响CTLA-4和Foxp3的表达，且两者的表达变化趋势相同。7.采用Elisa技术，检测正常CD4+CD25+Treg与siRNA-IL-37干扰CD4+CD25+Treg组细胞培养上清液中IL-10、TGF-β含量，结果表明siRNA干扰细胞两因子含量均有明显下降（P<0.01），表明CD4+CD25+Treg细胞IL-37的表达可能影响其抑制性细胞因子的生成。8. siRNA-IL-37干扰Treg与CD4+CD25-T共培养组，72h检测上清中IL-2的浓度。检测结果显示，CD4+CD25-T细胞分泌IL-2，加入正常CD4+CD25+Treg细胞后IL-2浓度下降（P<0.01），但siRNA-IL-37干扰CD4+CD25+Treg细胞组IL-2分泌水平明显上升（P<0.01）。阴性对照scramble干扰Treg组与CD4+CD25+Treg细胞组分泌情况无差异（P>0.05）。实验中IL-2由T细胞分泌，干扰CD4+CD25+Treg细胞IL-37表达水平，共培养上清IL-2浓度较正常对照组显著增加，推断IL-37在胞内表达可能与Treg细胞抑制CD4+CD25-T细胞IL-2的分泌相关。9. siRNA干扰CD4+CD25+TregIL-37表达后，其促进Th2极化能力下降，IFN-γ/IL-4浓度比值上升，较正常对照组有统计学差异（P<0.01），效应T细胞群向Th1趋势极化。实验结果显示，干扰CD4+CD25+Treg表达IL-37，IFN-γ/IL-4显著升高，因此，IL-37蛋白在胞内可能对CD4+CD25+Treg介导的Th2极化具有重要作用。结论：1.健康人体外周血CD4+CD25+Treg能够表达IL-37，在新鲜提取的健康人CD4+CD25+Treg细胞中IL-37存在并少量表达。2.随着CD4+CD25+Treg活化水平增高，IL-37表达水平逐渐升高，并在CD4+CD25+Treg细胞活性最强的72小时表达尤为明显。IL-37在胞质和细胞膜附近表达较丰富。3.IL-37能够影响CD4+CD25+Treg对CD4+T细胞免疫抑制水平。干扰IL-37在CD4+CD25+Treg中的表达，Treg对CD4+T细胞的免疫抑制功能减弱。