研究背景儿童脓毒症是危重患儿死亡的第一位原因,是当今儿童危重病医学所面临的棘手难题。持续血液净化技术(CBP)在脓毒症和严重脓毒症患儿治疗中广泛应用和深入研究,但目前对CBP的治疗机制缺乏足够的理解,有必要对这一治疗过程中的相应机制进行研究。目前尚未见到CBP治疗脓毒症患儿前后典型蛋白标志物变化情况研究,本研究主要对CBP治疗脓毒症患儿前后临床疗效做比较,探讨CBP治疗脓毒症指证及时机,并对典型蛋白标志物软骨糖蛋白39(YKL-40)及C反应蛋白(CRP)动态变化做深入研究,探讨CBP治疗脓毒症机制。目的本课题研究CBP治疗脓毒症患儿前后临床疗效,CBP治疗脓毒症指证及时机,分析CBP治疗脓毒症前后病情危重程度、炎性因子及YKL-40和CRP动态变化情况,并分析比较YKL-40、CRP与IL-6、TNF-α和脓毒症患儿病情危重程度做相关性分析,探讨脓毒症患儿疾病严重程度、预后与典型蛋白标志物的关系,为临床评价CBP治疗脓毒症提供治疗依据。第一部分方法根据2005年国际脓毒症会议发布小儿脓毒症诊断标准,收集北京军区总医院附属医院八一儿童重病中心2008年8月至2010年8月收治的符合严重脓毒症诊断标准的25例患儿,以同期门诊健康体检儿童25例为对照组。25例患儿在行CBP治疗前均进行了常规综合治疗、原发病的治疗、抗生素、营养对症支持治疗,维持水电解质酸碱平衡；25例患儿均需机械通气辅助呼吸,15例患儿需应用多巴胺及去甲肾上腺素维持血压。(1)在持续血液净化治疗儿童脓毒性休克患儿开始治疗即0小时、治疗开始12小时、24小时、48小时从桡动脉端抽血5mL和2mL,5mL血样低温离心后取上层血清冻存；2mL血样做血常规生化检查肾功能、肝功能、血电解质、血乳酸,并测定4个时间点的动脉血气,对以上结果做统计分析。根据1995年5月中华医学会儿科学会急救学组讨论通过的《小儿危重病例评分法(草案)》(评分法)对CBP治疗前后脓毒症患儿评分,反映患儿危重病情程度和预测死亡风险。(2)采用酶联免疫法测定4个时间点的IL-6、TNF-α水平值并做统计分析。结果(1)经CBP治疗,25例脓毒症患儿经临床好转18例,恶化死亡5例,放弃治疗2例,18例患儿经后续治疗后治愈出院,治愈率72%。①在CBP治疗脓毒症患儿开始后,Oh、12h、24h和48h平均动脉压结果分别为42.84±8.84 mmHg,54.80±12.67mmHg,55.96±12.48mrnHg,58.27±13.00 mmHg,平均动脉压不断上升,治疗后平均动脉压与治疗前比较,有显著性差异(F=54.031,P<0.001); 0h、12h、24h和48h多巴胺使用量为17.61±4.07μg/kg min、14.24±2.36μg/kg·min、8.51±2.39μg/kg·min、4.31±1.47μg/kg·min,治疗后多巴胺使用量与治疗前比较,有显著性差异(F=159.681,P<0.001),治疗后12h(P<0.001)、24h(P<0.001)和48h(P<0.001)多巴胺使用量与治疗前比较,均有显著性差异；0h、12h、24h和48h肾上腺素使用量为1.41±0.34μg/kg·min、0.63±0.21μg/kg·min、0.08±0.03μg/kg·min、0.03±0.02μg/kg·min,治疗后肾上腺素使用量与治疗前比较,有显著性差异(F=277.775,P<0.001),治疗后12h(P<0.001)、24h (P<0.001)和48h(P<0.001)肾上腺素使用量与治疗前比较,均有显著性差异；Oh、12h、24h和48h尿量分别为0.86±0.58 mL/kg. h,0.88±0.42 mL/kg·h,0.90±0.45 mL/kg. h,1.36±0.61 mL/kg. h,治疗后尿量与治疗前比较,有显著性差异(F=27.752,P<0.001),治疗后48h尿量与开始CBP治疗前治疗前比较,有显著性差异(P<0.001)。②在CBP治疗脓毒症患儿开始后,Oh、12h、24h和48h血肌酐水平分别为363.02±83.73μmol/L、230.20±58.39μmol/L、191.20±51.17μmol/L 103.71±30.89μmol/L,治疗后血肌酐水平与治疗前比较,有显著性差异(F146.343=,P<0.001),治疗后12h(P<0.001)、24h(P<0.001)和48h(P<0.001)血肌酐水平与治疗前比较,均有显著性差异；0h、12h、24h和48h尿素氮水平分别为39.83±8.72 mmol/L、23.55±6.44mmol/L、14.64±4.68mmol/L、7.71±1.61mmol/L,治疗后尿素氮水平与治疗前比较,有显著性差异(F=179.995=,P<0.001),治疗后12h(P<0.001)、24h(P<0.001)和48h(P<0.001)尿素氮水平与治疗前比较,均有显著性差异。③在CBP治疗脓毒症患儿开始后,0h、12h、24h和48h血气PH分别为7.14±0.43、7.33±0.48、7.36±0.44、7.31±0.40,治疗后血气PH与治疗前比较,无显著性差异；0h、12h、24h和48h血气BE分别为19.72±4.71、8.32±2.33、4.61±1.62、0.61±0.17,治疗后血气BE与治疗前比较,有显著性差异(F=264.709,P<0.001),治疗后12h(P<0.001)、24h (P<0.001)和48h(P<0.001)血气BE与开始CBP治疗前治疗前比较,均有显著性差异；0h、12h、24h和48h血气PO2/FiO2分别为187.49±44.28、247.01±70.07、300.97±55.27、351.53±80.59,治疗后PO2/FiO2水平与治疗前比较,有显著性差异(F=70.274,P<0.001),治疗后12h (P<0.001)、24h(P<0.001)和48h(P<0.001)PO2/FiO2水平与治疗前比较,均有显著性差异。④经CBP治疗后48h,患儿危重评分与治疗前比较,有显著性差异(t=-6.096,P<0.001)。(2)在CBP治疗脓毒症患儿开始后,0h、12h、24h和48h IL-6水平分别为706.90±275.95 ng/L.325.18±126.94 ng/L.212.07±82.79 ng/L. 162.59±63.47ng/L,治疗后IL-6水平与治疗前比较,有显著性差异(F=164.057,P<0.001),治疗后12h(P<0.001).24h(P<0.001)和48h(P<0.001) IL-6水平与治疗前比较,均有显著性差异；Oh、12h、24h和48h TNF-α水平分别为989.67±386.33ng/L.872.27±209.28 ng/L.541.25±207.28ng/L.439.08±159.37 ng/L,治疗后TNF-α水平与治疗前比较,有显著性差异(F=106.836,P<0.001),治疗后12h(P=0.033).24h(P<0.001)和48h(P<0.001)TNF-α水平与治疗前比较,均有显著性差异。治疗后IL-6、TNF-α水平呈现下降趋势,经CBP治疗脓毒症患儿48h后,患儿血清中炎性因子IL-6(t=4.653,P<0.001)和TNF-α水平(t=9.008,P<0.001)与正常患儿比较,有显著性差异。(3)8例存在肝功能衰竭患儿,CBP治疗前,患儿内环境严重紊乱,凝血机制差,总胆红素(258.98±117.38)U/L、血氨(189.31:±46.23)μg/dL. GPT(1281.19±363.18)U/L.GOT(1018.71±72.24)U/L.PTA(28.22±6.76)%. CBP治疗12h后症状减轻,内环境、出血指标显著改善,总胆红素(93.51±28.34)U/L、血氨(56.26±10.16)μg/dL.GPT(390.58±169.12)U/L.GOT(300.77±141.46)U/L.PTA(61.46±13.75)%.总胆红素(t=3.797,P=0.007)、血氨(t=9.391, P<0.001)、GPT(t=7.017,P<0.001)、GOT(t=13.897,P<0.001)、PTA (t=.12.553,P<0.001)治疗前后均有统计学意义。(4)掌握好脓毒症患儿CBP治疗指证、时机及实施方法,可明显提高脓毒症患儿治愈率。第二部分方法(1)采用酶联免疫法测定待测血清中YKL-40浓度,采用免疫比浊法测定血浆中CRP水平,根据标准品浓度与吸光度之间关系绘制标准曲线,算出回归方程,根据所测血清标本吸光度算出样本中YKL-40和CRP浓度。(2)制备脓毒症患儿全血总RNA,以RT-PCR法测定全血中YKL-40 mRNA相对表达含量。(3)获取脓毒症患儿外周血单核细胞,收集培养的细胞,加入PBS离心洗涤1遍,吸出上清,加入cell staining buffer,充分混匀,加抗人FITC-CD14抗体或FITC-CD16抗体,室温避光孵育,用cell staining buffer重悬后行FCM检测,每次重复3次,取平均值CXP软件分析；用细胞免疫化学法检测脓毒症患儿外周血单核细胞中YKL-40的定位表达。结果(1)在CBP治疗脓毒症患儿开始后,患儿外周血中0h、12h、24h和48h YKL-40蛋白浓度分别为177.93±58.74μg/L、100.57±37.37μg/L、80.16±28.46μg/L、59.75±21.03μg/L,治疗后YKL-40与治疗前比较,有显著性差异(F=172.466,P<0.001)；患儿外周血中0h、12h、24h和48h CRP蛋白浓度分别为664.49±259.40μg/L、619.01±206.81μg/L、201.13±75.42μg/L、120.17±46.91μg/L,治疗后CRP水平与治疗前比较,有显著性差异(F=172.262,P<0.001),治疗后12h (P=0.026).24h(P<0.001)和48h(P<0.001)CRP水平与治疗前比较,均有显著性差异。CBP治疗48h后脓毒症患儿外周血YKL-40浓度与健康儿童比较,无显著性差异。(2)在CBP治疗后YKL-40mRNA△Ct表达含量与治疗前比较,无显著性差异；患儿外周血中0h、12h、24h和48h YKL-40 mRNA相对表达含量(2-△△CT)分别为1(0.6-1.7)、0.5(0.4-0.6)、0.5(0.3-0.7)、0.4(0.2-0.6)。(3)YKL-40阳性外周血中CD14呈低表达,CD16呈阳性表达,且在CBP治疗脓毒症患儿开始后,患儿外周血中0h、12h、24h和48h CD16表达率分别为35.23±8.15%、26.42±6.11%、27.86±6.57%、23.67±4.85%,呈下降趋势,治疗前后有显著性差异(F=153.901,P<0.001);CBP治疗脓毒症患儿48h后,外周血中CD16表达率接近健康儿童；经细胞免疫化学法检测,外周血细胞单核细胞中YKL-40阳性表达。(4)经CBP治疗恶化死亡5例脓毒症患儿外周血中YKL-40.CRP水平和CD16表达率较生存组患儿显著升高,与生存组患儿比较,有显著性差异(P<0.001)。第三部分方法收集第一部分、第二部分CBP治疗脓毒症患儿YKL-40、CRP、IL-6、TNF-α、IL-6浓度及危重评分数据,经SPSS13.0统计分析,采用Pearson相关分析分别做YKL-40、CRP对TNF-α、IL-6和YKL-40、CRP对CBP治疗脓毒症患儿前后危重评分做相关性分析。结果经CBP治疗48小时后, YKL-40浓度与IL-6浓度相关具显著性,且呈密切正相关(r=0.905, P<0.001), YKL-40浓度与TNF-α浓度相关具显著性,且呈密切正相关(r=0.890, P<0.001); CRP浓度与IL-6浓度相关具显著性,且呈密切正相关(r=1.000, P<0.001), CRP浓度与TNF-α浓度相关具显著性,且呈密切正相关(r=0.987,P<0.001)。经CBP治疗48小时后, YKL-40浓度与危重评分相关具显著性,且呈中度正相关(r=0.662, P<0.001); CRP浓度与危重评分相关具显著性,且呈密切正相关(r=0.772,P<0.001)。结论1持续性血液净化技术治疗能明显提高脓毒症患儿氧合能力、纠正酸中毒、改善组织灌注、清除小分子物质、稳定血压并减少升压药用量,改善预后并降低死亡率。2掌握好上CBP的指证及时机和实施方法是提高脓毒症患儿治愈率的重要一环。3持续性血液净化技术是脓毒症患儿有效治疗手段,其清除体内炎性细胞因子是其治疗脓毒症的可能机制。合并急性肝功能衰竭的患儿,肝性脑病ⅡⅡ级以前及时行CBP是较好的时间点。4 YKL-40和CRP均有可能成为评价持续性血液净化技术治疗脓毒症疗效的蛋白指标,CBP治疗后,外周血中YKL-40、CRP水平高及持续CD16高表达提示脓毒症患儿预后较差。