富马酸又名反丁烯二酸，是一种重要的有机化工原料和精细化工产品，被广泛应用于材料、医药、化工、食品及饲料添加剂等领域。近年来生物发酵法生产富马酸由于原料可再生、反应条件温和及环境污染小等优点，越来越受到研究者的关注。米根霉（Rhizopusoryzae）是发酵法制备富马酸的重要工业菌种，但是富马酸的生产速率较低，所以研究富马酸积累的原理及提高富马酸的生产速率至关重要。　　近年来的工业生物技术的相关研究表明，ATP、NADH及NADPH等能量因子参与了各种重要平台化学品和聚合物的合成途径，对目标产物的合成速率及积累具有重要影响。交替呼吸途径(alternativerespirationpathway，ARP)，广泛存在于高等植物及部分真菌和藻类中，交替呼吸途径以其非磷酸化电子传递途径，起到了能量溢流(energyoverflow)的作用，调节细胞能量代谢，平衡碳代谢和电子传递。本文首次在米根霉发酵生产富马酸的过程中发现了交替呼吸现象，对呼吸途径、呼吸强度与富马酸合成途径的适配性进行深入研究，阐释交替呼吸途径在富马酸合成过程中的生理功能，以全新的视角来探究促进富马酸高效合成的方法。本论文主要工作如下:　　(1)首次在米根霉发酵产富马酸的过程中发现了交替呼吸现象，并表征了交替呼吸关键酶——交替氧化酶(AOX)的基因aox。抗霉素A和水杨氧肟酸(salicylhydroxamicacid，SHAM)分别是细胞色素呼吸途径和交替呼吸途径的特异性抑制剂。在米根霉产酸发酵24h时，加入抗霉素A或SHAM均只能抑制米根霉的部分呼吸，抗霉素A和SHAM对米根霉呼吸的抑制率分别为60.1％和33.2％;只有同时加入抗霉素A和SHAM时才能几乎完全抑制米根霉的呼吸。说明米根霉中至少存在两条呼吸途径，一条是对抗霉素A敏感的细胞色素呼吸途径，另一条是对SHAM敏感的交替呼吸途径。将米根霉基因组信息中推测为交替氧化酶功能基因的aox导入大肠杆菌中，经IPTG诱导后，在重组菌中会产生对抗霉素A不敏感，而对SHAM敏感的交替呼吸现象。让本来不具有交替呼吸途径的大肠杆菌产生交替呼吸现象，也从侧面证明了米根霉的交替呼吸途径是由aoX转录翻译的AOX催化的。　　(2)研究了米根霉交替呼吸强度与富马酸生产速率之间的关系。米根霉在发酵过程中，交替呼吸的强度与富马酸生产速率的相关性非常好，都是前24h迅速增加，在24h时同时达到最高点，随后有所下降，36h之后交替呼吸的比例维持在40％左右，富马酸的生产速率维持在0.4-0.5g/L/h。在发酵过程中，加入少量的交替呼吸链的特异性抑制剂SHAM，富马酸的产量和生产速率明显下降;加入1.0mM的SHAM，富马酸产量和生产速率分别下降了27％和30％。说明在米根霉的产酸阶段，交替呼吸途径对富马酸的生产速率有重要的影响;交替呼吸强则富马酸生产速率高，交替呼吸弱则富马酸生产速率低。　　(3)研究了米根霉交替呼吸的调控方式。考察了不同碳源、碳氮比对米根霉aox转录水平、交替呼吸强度及富马酸生产速率的影响，结果发现:用木糖作为碳源培养米根霉时，细胞中不存在交替呼吸现象，富马酸的产量只有5.3g/L，远低于用葡萄糖作为碳源时的富马酸产量。通过考察碳氮比对米根霉产酸和交替呼吸强度的影响时发现，米根霉在氮源丰富的培养基中（尿素浓度:2.0g/L）时，富马酸产量最低，仅为13.8g/L，此时交替呼吸强度与aox转录水平也较低;而在限氮条件下（尿素浓度:0.1g/L），富马酸产量达到40.5g/L，此时交替呼吸强度与aox转录水平也较高。上述结果说明米根霉中的交替呼吸途径可受到营养条件的诱导调控，木糖不能诱导米根霉交替呼吸途径的产生，而氮胁迫能诱导交替呼吸的产生。且aox的转录水平与米根霉交替呼吸强度的相关性较好，表明米根霉的交替呼吸强度可通过aox的转录水平来进行调控。　　(4)考察了不同化学物质（锰离子、氯霉素、抗霉素A）对米根霉交替呼吸强度及富马酸积累的影响。锰离子(Mn2+)是线粒体中蛋白质合成的必要元素，充足的Mn2+有利于细胞色素呼吸途径中化合物的合成，保障细胞色素呼吸途径的畅通;而氯霉素(chloramphenicol，CAC)与Mn2+相反，通过抑制线粒体中蛋白质的合成，进而抑制细胞色素呼吸途径。在米根霉产酸稳定阶段(30h)，向发酵培养基中加入100mg/L的Mn2+，富马酸的产量和交替呼吸强度分别下降了30.98％和31.8％。而加入50mg/L的氯霉素，富马酸的产量和交替呼吸强度分别增加了5.3％和15.71％。而在米根霉发酵初始阶段，加入细胞色素呼吸的特异性抑制剂抗霉素A能明显的增强交替呼吸强度，达到86.82％，但富马酸的生产速率却下降了41.95％。表明交替呼吸途径与富马酸生产强度存在关联，但并不是任何阶段都是交替呼吸途径越强越好。在发酵前期，过高的交替呼吸强度，不利于米根霉的生长和富马酸的积累;在发酵后期，处于米根霉稳定的产酸阶段，交替呼吸途径有利于米根霉的产酸。