芸香科Rutaceae柑橘属Citrus L植物药用历史悠久,许多常见中药材如陈皮、青皮、枳实、枳壳、化橘红、橘红、橘叶、橘络、橘核、佛手等均来自该属植物。源于该属的药材在中药性效、化学成分、药理作用等方面既存在共性,又各具特征。代表性药材陈皮Citri Reticulatae Pericarpium (CRP)、青皮Citri Reticulatae Pericarpium Viride (CRPV)即充分体现了这一特点。陈皮、青皮同来源于柑橘属柑橘Citrus reticulata Blanco种及其变种,因不同的采收期而成为两味中药。陈皮为9-12月果实成熟时采摘的果皮；青皮为5-6月收集自落的幼果(个青皮),或7-8月采收的未成熟果实的果皮(四花青皮)。陈皮、青皮均为理气药,但临床应用和作用特点各有不同。陈皮的功效为理气健脾,燥湿化痰；青皮的功效为疏肝破气,消积化滞。陈皮长于理气健脾,青皮长于疏肝破气。陈皮作用部位主要在中上焦,青皮主要在中下焦。二者来源相同,是体现中药“一体二用”的代表。“一体二用”是指来源于同一基原植物和同一入药部位,因不同的生长期采收而成为功效、作用特点、临床应用不同的两味中药。陈皮和青皮因有相同的遗传背景和次生代谢产物合成途径,可将二者作为模式药物进行中药“一体二用”的研究。陈皮、青皮的活性成分主要包括挥发油、黄酮成分。目前,关于陈皮、青皮的研究报道主要集中于黄酮类成分,而对具有较强生物活性的挥发油关注较少。已有的研究表明,挥发油是陈皮、青皮产生理气作用的主要部位。陈皮、青皮具有相同的性味,但其调气作用有强弱之别,陈皮为理气健脾,青皮为疏肝破气。基于此,从临床作用和化学成分的相关性考虑,理气作用的强弱应与其挥发油中所含主要成分含量有关；《中国药典》2010版仅以橙皮苷一个成分作为陈皮、青皮药材的质量控制指标,并未将挥发油成分纳入品质评价体系,这不能全面的反映陈皮、青皮品质；此外,由于柑橘挥发油优良的芳香品质及丰富的资源,它被认为是制作食品、饮料、化妆品的主要香料来源。鉴于此,本文对陈皮、青皮挥发油成分做了一较系统、全面、深入的研究。研究结果为揭示阐明“品种-成分-性效”相关性,中药“一体二用”的科学内涵奠定了一定的基础；并对柑橘果皮的综合利用,橘皮精油的产业化建设,促进地方经济发展具有重要意义。具体研究内容及实验结果如下：1.陈皮、青皮挥发油提取、GC-MS分析方法学研究1.1提取方法学研究在实验室已建立方法的基础上,通过系统查阅文献及实际操作,确定了一较好的提取方案。目前国际上,对于新鲜柑橘果皮精油的提取主要采用压榨法,因为这能充分地保障橘皮精油优良的芳香品质。但由于陈皮、青皮是以干燥的橘皮入药,因此压榨法并不适用于两药挥发油的提取。基于此,本研究仍采用经典的水蒸汽蒸馏提取法,具体方案如下：取粉碎后的样品约10-30g与约10倍量(V/W)蒸馏水(mL)于40℃时在一挥发油提取器(Clevenger-type apparatus)中溶胀1h,随后提取挥发油3-4h,得无色或淡黄色澄明油状液体。提取完毕后,即让挥发油在提取装置中静置1h,后读取挥发油的量(mL),并收集。挥发油于约5℃时通过无水硫酸钠脱水24h,后装于具塞小瓶,置于冰箱中,以备气相色谱-质谱(Gas Chromatograph-Mass Spectrometer, GC-MS)分析所需。计算挥发油的收率(v/w)。结果表明该方法切实可行,提取效果较好。从各样品挥发油得率看：广陈皮的挥发油得率(3.56-8.71%)明显高于其他陈皮、青皮(<0.7-4.2%)。从实验结果来看,为了确保有足够的挥发油(≥0.1mL)供分析用,应当确保样品的量为：广陈皮不少于10g(贮藏年限较长的广陈皮价格较高),其他陈皮、青皮不少于25g,提取溶剂用量约为样品量的10倍(V/W)。1.2GC-MS分析方法学研究同样地,在实验室已有分析方法的基础上,通过系统查阅文献及实际操作,确定本研究中采取的方法为：Agilent7890A/5975C GC-MS气相色谱一质谱联用仪(美国),匹配一化学工作站MSD ChemStation E.02.01.1177,质谱图匹配的谱库为NIST (National Institute of Standards and Technology,美国国家标准技术研究所)08MS database。色谱柱HP-5MS5%Phenyl Methyl Siloxane (30m×0.25mm×0.25μm)。柱箱升温程序：初始温度60℃,保持3min,以4℃/min的速率升至250℃。载气为He,恒定流速1mL/min。进样口(气化温度),离子源的温度分别为280,230℃。分流比20：1。溶剂延迟：3.00min。电离方式：El (Electron impact)源；电子能量：70eV；质量范围(m/z):30～350amu;扫描间隔：2.29scans s-1。进样前,样品被稀释为10%的n-hexane(正己烷)溶液。进样量1μL。通过本研究发现,以上参数还可进一步的优化,具体有：由于在药材FCI-1-b, FCI-2-b, FCI-3-b挥发油中鉴定的化合物Pentacosane(正二十五烷)的分子量为352,超出了350的上限,因此恰当的质量范围(m/z)应为：30-400amu。2中药挥发油成分定性方法学研究——以陈皮、青皮为例2.1中药挥发油总离子流谱图中重叠峰的拆分中药挥发油是一个十分复杂的体系,含有数以百计的化学成分,且许多成分性质相近,这导致应用GC-MS分析得到的总离子流谱图(Total ion chromatogram, TIC)中存在着大量的重叠、甚至内嵌峰。如何对这些重叠峰进行拆分,并定性,将对挥发油成分的正确分析起到至关重要的作用。本研究应用气-质化学工作站(ChemStation)匹配的／AMDIS (Automated Mass Spectral Deconvolution&Identification System,自动质谱退卷积定性系统)拆分中药挥发油TIC中的重叠峰：并首次系统、深入地阐述了如何应用该程序拆分中药挥发油TIC中的重叠峰(以陈皮、青皮为例)。该研究具有较好的创新性和实用性,对于解决色谱分析中色谱峰重叠问题具有很好的启示作用。研究结果表明,AMDIS能初步分析TIC中含有多少化合物。而后,通过对各待鉴定化合物对应扫描点提纯谱图及该扫描点原始谱图与参考谱库中各匹配化合物的比对、分析,确定其结构；或否定某处提纯谱图及其对应的化合物(即此提纯谱图并不合理,其对应的化合物实际并不存在)。进一步,通过选择各化合物的特征性碎片离子峰,并分析它们的变化规律,可确认已有的鉴定结果。尤其,当被鉴定物浓度较低,且受到干扰时,AMDIS分析方法具有较大优势。它能有效去除干扰并获得“纯净”的谱图信息,从而增大目标化合物定性的可靠性。不过,当2个化合物的保留时间十分接近时,AMDIS有可能会漏检。总之,AMDIS的提纯质谱图的功能,可有效地对重叠峰中混合质谱图进行拆分,进而准确的对各物质定性。2.2Kovdts保留指数在中药挥发油成分定性中的作用随着GC-MS的普及,现在,对于中药挥发油成分的定性主要通过MS完成。但是仅仅依靠MS对化合物定性是不够的,因为许多萜烯类化合物有着基本相同的质谱。因此对于补充质谱数据而言,一些关于保留行为的知识是非常需要的。这其中最著名的就是Kovats于1958年提出的保留指数(Retention index, RI)概念。本研究应用Van den Dool与Kratz提出的公式计算程序升温保留指数(temperature-programmed retention indices,IP)。研究结果表明,保留指数在中药挥发油成分定性中发挥着重要作用,具有很大的参考价值。对于中药挥发油成分的鉴定,应将MS与保留指数结合起来,保留指数和其它手段综合定性是气相色谱发展的重要趋势之一。3中药挥发油成分定量方法学研究——以陈皮、青皮为例应用2.2中的方法对TIC中的谱峰定性,定性后的色谱峰采用总体积积分和归一化法进行定量,并假定所有化合物的响应因子均为1。尽管面积归一化法是一较粗略的定量方法,但由于其操作简便,因此本研究中仍采用此方法定量。对于TIC中的重叠峰,应用AMDIS拆分定性后,通过各定性化合物的特征性碎片离子峰对各物质进行一大致的峰面积定量。研究结果表明，此方法切实可行,数据可靠。4同来源陈皮、青皮挥发油成分比较研究由于陈皮、青皮的来源复杂,为了确保一个真正的比较研究,实验中的药材均首次采用了定种、定产地、定植株(1棵或相邻的几颗)的方法进行收集。同时,实验中各批次药材的提取方法也相同。因此遗传因素,生态环境,及技术参数的影响均被去除,一个真正的比较分析实验得以进行。共对来源于2个变种：大红袍(产地：重庆市璧山县、四川夹江马村)、椪柑(产地：四川蒲江)总计19批药材进行了研究。研究结果表明不同采收时间的陈皮、青皮(大红袍、椪柑)挥发油成分在性质、含量上均有一定的差异。并且源于不同变种的陈皮、青皮在挥发油大类成分上均呈现一致的变化规律：即随着采收时间的延长,单萜烯类成分的含量呈现先升高,再降低的趋势；含氧化合物含量呈现先降低,再升高的趋势。以挥发油成分含量为变量进行聚类分析,结果将不同采收期橘皮分为3类：早期采收的橘皮、中期采收的橘皮、晚期采收的橘皮,这与按采收期不同将橘皮分为个青皮、青皮、陈皮3类一致。5不同贮藏年限广陈皮(新会陈皮)挥发油成分对比研究研究结果表明源于茶枝柑的不同贮藏年限的广陈皮(新会陈皮)拥有几乎相同的物质基础。直观及聚类分析均表明：贮藏期为4年的新会陈皮挥发油成分与其他5批贮藏年限更长的新会陈皮有较显著性差异,后5批之间的差异性并不显著。与4年新会陈皮相比,后5批广陈皮总单萜烯类化合物含量有所升高,而总含氧化合物含量则降低。这表明,就挥发油类成分而言,陈皮确实需要“陈”,但这种“陈”也是有限度的,“陈”到一定程度即达到最佳。具体的变化趋势和内在规律还需要在今后的研究中做进一步探讨。传统认为,陈皮在存放过程中,挥发性成分多已挥发,使得其他成分能更好地发挥药理作用。但本研究发现,随着贮藏年限的延长,挥发油的得率并未降低,这说明挥发油类成分仍是新会陈皮发挥药效的重要物质基础。6陈皮、青皮、橘皮挥发油化学型分析Lota等根据化合物柠檬烯(Limonene)与γ-萜品烯(y-Terpinene)的含量,将来源于不同柑橘变种果皮挥发油的化学型分为两类：柠檬烯(83.8～96.2%)型与柠檬烯/γ-萜品烯(52.2～81.3%/11.2～36.7%)型。受Lota的启发,并在Lota的基础上,本研究首次系统分析了源于不同变种、不同产地陈皮、青皮(橘皮)挥发油的化学型。已有的研究结果表明,区分陈皮、青皮挥发油的化学型主要看4个物质的含量高低,即：柠檬烯、γ-萜品烯、芳樟醇(Linalool)、2-甲氨基苯甲酸甲酯(Benzoic acid,2-(methylamino)-, methyl ester)。据此,本研究中来源于大红袍、椪柑的陈皮、青皮(橘皮)挥发油归属于柠檬烯/芳樟醇型；源于茶枝柑的广陈皮挥发油归属于柠檬烯/γ-萜品烯/2-甲氨基苯甲酸甲酯化学型。7挥发油成分在陈皮、青皮品质评价中的作用本研究表明,挥发油成分在陈皮、青皮品质评价系统中具有重要作用。首先,同来源的陈皮、青皮挥发油成分具有显著性差异,并且这种差异的总体特征在来源于不同变种、不同产地的陈皮、青皮均一致。直观分析及聚类分析均表明：这种变化趋势与传统的按采收时间将橘皮分为个青皮、青皮、陈皮3种类型也是一致的。其次,就挥发油成分而言,陈皮中来源于茶枝柑的道地药材“广陈皮”与其他陈皮、青皮具有显著性差异。从化学型上来看,广陈皮具有一特殊的化学型；另从挥发油在药材中的含量来看,广陈皮也明显高于其他陈皮、青皮。因此可以推断,广陈皮之所以成为道地药材,并显现比其他陈皮更好的药效,挥发油成分发挥了重要的作用。据此,建议《中国药典》在今后的版本中将挥发油成分纳入陈皮、青皮品质评价体系,具体如下：化学型概念,得率,籍此将广陈皮与其他陈皮区分；挥发油成分中两大主成分(总单萜烯、总含氧化合物)的含量比例关系,籍此区分个青皮、青皮、陈皮。此结论与课题组之前对陈皮、青皮次生代谢产物之黄酮化合物研究结果一致,即：在品质评价体系的构建中,建议将广陈皮与陈皮区分,个青皮与四花青皮区分。