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目的脑缺血再灌注损伤后缺血半暗带区神经元细胞的死亡方式即细胞凋亡,其中溶酶体组织蛋白酶B(Cathepsin B)、Caspase家族蛋白中的caspase9、caspase3蛋白均发挥了重要作用,但关于三者相互关系的研究较少,参与凋亡的机制尚不明确。本实验通过建立大鼠大脑中动脉脑缺血再灌注损伤模型,采用组织蛋白酶B的抑制剂CA-074ME和Caspase-9抑制剂Z-LEHD-FMK进行干预,检测脑缺血再灌注不同时间点后各组Cathepsin B、Caspase-9、Caspase-3蛋白表达变化,分析Cathepsin B与Caspase-9-Caspase-3凋亡信号通路在大鼠脑缺血再灌注损伤过程中的相关关系。并通过电镜观察两干预剂干预前后的各个时相溶酶体超微结构变化,进一步从微观方面探讨各信号通路和溶酶体之间相互关系。方法选取清洁级健康雄性Sprague-Dawley(SD)大鼠262只进行MCAO模型制作,鼠龄为10~12周之间,体重为240~280g之间。采用完全随机设计法将大鼠随机分为四个大组,分别为:假手术组(简称Sham组)16只;脑缺血再灌注组(简称IRI组)82只;Cathepsin B抑制剂CA-074ME干预组(简称CBI组)82只;Caspase-9抑制剂Z-LEHD-FMK干预组(简称C9I)82只。除Sham组外其余三组大鼠分别按0min、15min、30min、2h、6h、12h六个时间点每个时间点每组11只及24h组16只随机分为7个亚组。本实验采用改良longa线栓法制作大鼠右侧大脑中动脉局灶性缺血再灌注损伤模型(middle cerebral artery occlusion,MCAO),假手术对照组除插线不阻断大脑中动脉血流外,其余手术步骤同其它组。采用侧脑室穿刺法注入药物:CBI组于造模前60min右侧侧脑室穿刺注入抑制剂CA-074ME(2μg/μl×5μl),C9I于造模前30min右侧侧脑室穿刺注入抑制剂Z-LEHD-FMK(0.96μg/μl×5μl),Sham组及IRI组于造模前30分钟于右侧侧脑室注入同等剂量的DMSO溶液。阻断右侧大脑中动脉血流2h后再灌注,分别于再灌注后0min、15min、30min、2h、6h、12h、24h七个时间点对大鼠运用Longa’s 5级标准评分法评判神经功能缺失情况并断头取脑;分别从四组大鼠中取5只再灌注24h后时间点大鼠行TTC染色法检测,观察各组大鼠24h时间点相对脑梗死体积大小;TUNEL检测四个大组在7个不同时间点脑缺血区域神经细胞凋亡数;使用Western blotting法检测四组不同时间点的Cathepsin B、Caspase-9、Caspase-3蛋白表达变化;电镜酶组织细胞化学法观察各信号通路关键蛋白的特异性抑制剂干预前后的各个时相溶酶体超微结构变化。结果1.造模成功率88.5%。Sham组大鼠神经功能缺损不明显;IRI组、CBI组及C9I有不同程度神经功能缺损,CBI组及C9I组大鼠的神经功能缺损症状与IRI组相比较轻,评分较低(P<0.05)。2.TTC染色法检测大鼠大脑再灌注24h后脑梗死可见,Sham组脑组织均一红染,未见明显白色梗死灶,IRI组、CBI组、C9I组均可见白色梗死灶,与模型组比较,干预组梗死面积较少(P<0.05)。3.TUNEL法检测脑缺血再灌注损伤后大脑缺血侧皮质区神经细胞凋亡数目观察到,Sham组可见极少数凋亡细胞,IRI组的凋亡细胞较Sham组明显增多,七个时间点均可见不同数量凋亡细胞,随着缺血再灌注时间点延长凋亡细胞阳性率逐渐升高,CBI组、C9I组0min、15min、30min、2h、6h、12h、24h时间点凋亡细胞数增长趋势与IRI组相同,但与IRI组相比较,两抑制剂组在各时间点的凋亡细胞数阳性率明显减少(P<0.05)。4.Western blotting法检测脑缺血再灌注后不同时间点下cathepsin B、caspase9、caspase3的蛋白表达,Sham组中可见三种蛋白少量表达,IRI组中三种蛋白表达量较Sham均明显增加,差异具有统计学意义(P<0.05);IRI组cathepsin B蛋白于再灌注后0min即开始表达,15min达高峰,30min、2h呈下降趋势,6h再次达高峰,较前一高峰表达增加,12h开始下降,24h下降较明显,但仍有较高表达;C9I组cathepsin B蛋白表达趋势同IRI组,但各时间点与IRI组比较,差异不具有有统计学意义(P>0.05);CBI组cathepsin B蛋白于再灌注后0min即开始表达,15min达高峰,之后的时间点蛋白表达呈减少趋势,在同一时间点蛋白表达量与IRI组相比较明显减少,差异具有统计学意义(P<0.05)。IRI组再灌注后0min即可检测到caspase9蛋白,之后开始上升,高峰出现在30min,2h、6h、12h、24h时间点表达量逐渐下降,CBI组及C9I组Caspase9蛋白表达趋势与IRI组一致,但两组各时间点蛋白表达量较IRI组明显减少,差异具有统计学意义(P<0.05)。IRI组再灌注后0min可见caspase3表达上调,15min、30min、2h蛋白表达量逐渐上升,6h达高峰,12h、24h表达量逐渐下降,CBI组及C9I组caspase3蛋白表达趋势与IRI组一致,但两组各时间点蛋白表达量较IRI组明显减少,差异具有统计学意义(P<0.05)。5.电镜观察显示随着缺血再灌注时间延长,缺血半暗带溶酶体体积逐渐增大,次级溶酶体数量逐渐增多,脑缺血再灌注损伤后期,神经细胞呈现凋亡特征。CBI组及C9I组同IRI组相比较,同时间点的细胞组织结构较清晰。结论1.大鼠脑缺血再灌注损伤后,脑缺血半暗带Cathepsin B与Caspase-9、Caspase-3的表达具有一定相关性。Cathepsin B可能通过Caspase-9-Caspase-3内源性信号通路介导细胞凋亡。2.大鼠脑缺血再灌注损伤后,CA-074ME可能通过抑制Cathepsin B减少Caspase-9及Caspase-3的表达,减少细胞凋亡和脑梗死体积;Z-LEHD-FMK可能通过抑制Caspase-9,从而抑制Caspase-9-Caspase-3的凋亡级联反应,发挥神经保护作用,减轻细胞凋亡。