研究背景动脉粥样硬化(Atherosclerosis, AS)是冠状动脉粥样硬化性心脏病(coronary atherosclerotic heart disease, CAD)的主要病理基础。也是心血管系统疾病中最常见的疾病,严重危害人类健康,而AS的发病机制至今尚未明确。随着动脉粥样硬化研究的不断深入,人们逐渐认识到炎症反应是AS发生、发展过程的的病理基础。抗炎治疗是防治AS相关疾病的重要策略之一。内脏脂肪素(visfatin)是新发现的一种脂肪细胞因子,已有研究visfatin通过促炎症反应在AS的发生和发展中起重要作用。临床研究显示,冠心病患者血浆的visfatin的升高伴有白介素-6(interleukin-6, IL-6)、肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor-a)等炎症介质的升高。且研究发现2型糖尿病患者的血浆visfatin水平与血管内皮细胞功能成显著负相关,而众所周知血管内皮损伤是AS发生的始动环节之一,从起始环节干预AS的形成,保护血管内皮免受各种炎症因子的作用,是抗AS发生的关键。丝裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase, MAPK)是一类存在于真核细胞中的丝/苏氨酸蛋白激酶。MAPK包括了3种主要的亚家族：SAPK/JNK(stress-activated protein kinases/c-Jun NH2-terminal kinases)、 ERKl/2(extracellular signal-regulated protein kinase,ERK)和p38分裂原激活蛋白激酶(p38mitogen-activated protein kinase,p38MAPK)。其中P38MAPK和JNK通路主要对炎性细胞因子和多种类型的细胞应激信号进行传导,与细胞分化、细胞凋亡、应激反应密切相关。且已有研究已表明P38MAPK、JNK通路均参与了AS的病理过程。本研究旨在探讨Visfatin是否受P38MAPK、JNK信号分子的调节诱导HUVEC损伤从而参与AS炎症反应。定心方(Dingxin Recipe, DXR)由丹参、三七、赤芍、瓜萎、茯苓、党参、灵芝、酸枣仁、苦参、黄连等组成,具有益气活血祛痰燥湿之功效,临床研究证明其对冠心病有良好的疗效,其对缺血及再灌注过程的炎症激活有显著的抑制作用同时降低缺血再灌注损伤大鼠JNK和P38MAPK蛋白的表达,增强ERK蛋白的表达来。本论文要探讨定心方是否受P38MAPK和JNK信号通路调控发挥保护由visfatin诱导损伤的HUVEC,从而起到抗AS的作用。第一章visfatin对HUVEC增殖抑制及定心方含药血清的干预目的：不同浓度及时间visfatin对HUVEC增殖影响不同浓度及时间DXR含药血清对HUVEC增殖影响DXR含药血清对visfatin抑制的HUVEC的增殖影响方法及分组：定心方含药血清的制备：60只雄性SD大鼠,体重200-250g,随机分为2组,每组30只,分别灌服定心方水煎剂和等体积生理盐水。定心方给药剂量为18.59g/kg/d,每日药量分两次灌胃,连续7d。末次给药前,禁食不禁水12h,末次给药2h后行10%水合氯醛(4ml/kg)麻醉,腹主动脉采血。血标本4℃静置4h,3500r/min离心10min,分离血清,0.22μ.m微孔滤膜过滤除菌,56℃灭活30mmin,每只大鼠血清单独分装,-80℃保存备用。Visfatin浓度组：分别用0、50、100、200μg/Lvisfatin处理HUVEC24h。Visfatin时间组：以100μg/L visfatin分别处理HUVEC0、6、12、24、48h。DXR含药血清浓度组：将提出的含药血清分别稀释为0、0.25%、0.5%、1%、2%、5%、10%、20%DXR含药血清加入HUVEC作用24h。DXR含药血清时间组：用0.5%DXR含药血清分别作用0、6、12、24、48h。DXR含药血清及相关的通路抑制剂预处理细胞分组：P38MAPK通路分组：①正常对照组；②Visfatin+SB203580:SB203580(终浓度为10μmol/L)预孵育细胞30min,加入终浓度为100μg/L Visfatin刺激24h；③Visfatin+DXR药物血清组：加入5%DXR药物血清预孵育1h,加入终浓度为100μg/L Visfatin刺激24h；④Visfatin组：加入终浓度为100μg/L Visfatin刺激24h；⑤Visfatin+空白血清组：加入5%空白血清预孵育1h,加入终浓度为100μg/L Visfatin刺激24h。JNK通路分组：①对照组；②visfatin+DXR药物血清组：加入5%DXR药物血清预孵育1h,加入终浓度为100μg/L的Visfatin刺激24h；③Visfatin+空白血清组：加入5%空白血清预孵育1h,加入终浓度为100μg/L的Visfatin刺激24h；④visfatin组：加入visfatin100μg/L刺激24h；⑤visfatin+SP600125组：加入SP600125(终浓度为10μmol/L)预处理细胞30min,再给予visfatin100μg/L刺激24h。MTT比色法测定HUVEC的增殖：将HUVEC接种于九十六孔板,按实验分组给予相应的处理因素后,每组设6个复孔。按MTT法具体操作步骤进行操作,在酶标仪490nm处测其OD值。结果：1.不同浓度及时间的Visfatin对HUVEC增殖的影响与对照组比,50μg/Lvisfatin作用24h对HUVEC增殖无显著抑制作用,100、200μg/L visfatin作用24h抑制]HUVEC增殖具有显著性(P<0.01)经统计学处理两组间差异无显著性；100μg/L visfatin作用6、12h无明显抑制HUVEC增殖,作用24、48h均能显著抑制HUVEC增殖(P<0.05或P<0.01),经统计学处理两组间差异无显著性。2.不同浓度及时间DXR含药血清对HUVEC的增殖影响与对照组比,0、0.25%、0.5%、1%、2%DXR含药血清作用24h对HUVEC的增殖无显著性影响；5%、10%、20%DXR含药血清作用24h均能显著性的增强细胞的增殖(P<0.01),经统计学处理组间差异无显著性。与对照组比,5%DXR含药血清作用6、12h对HUVEC的增殖无显著性影响；5%DXR含药血清作用24、48h均能显著性的增强细胞的增殖(P<0.01),经统计学处理组间差异无显著性。3.DXR含药血清及SB203580、SP600125对visfatin损伤的HUVEC增殖影响与对照组比,visfatin与空白大鼠血清作用24h均可以显著性的抑制HUVEC的增殖(P<0.01)；与visfatin组比,5%DXR含药血清、SB203580、SP600125作用24h可以增强由visfatin损伤的HUVEC增殖(P<0.01)。结论：visfatin能显著抑制HUVEC的增殖,DXR含药血清、p38MAPK通路抑制剂SB203580、JNK通路抑制剂SP600125可以增强由visfatin诱导抑制HUVEC的增殖。说明visfatin有可能受p38MAPK、JNK信号通路调节抑制HUVEC增殖。而DXR含药血清也有可能通过调节它们来保护HUVEC。第二章visfatin诱导的HUVEC分泌IL-6和TNF-α及定心方含药血清的干预目的：不同浓度及时间Visfatin诱导HUVEC分泌IL-6和TNF-α的影响DXR含药血清对Visfatin诱导的HUVECIL-6和TNF-α的含量影响方法及分组：visfatin时间梯度与浓度梯度分组同第一章。DXR含药血清及相关的通路抑制剂预处理细胞分组同第一章。将HUVEC以1×105/mL的密度接种于培养皿,按不同实验目的进行分组处理,处理完毕后,收集细胞上清,分别按照IL-6和TNF-α试剂盒说明书进行操作,在酶标仪450nm波长处测量每组OD值。实验重复三次以上。结果：1.不同时间及浓度Visfatin对HUVEC上清液中的IL-6和TNF-α含量的影响与对照组比,50μg/Lvisfatin作用24h对HUVEC上清液中的IL-6和TNF-a水平无明显增高,100、200μg/Lvisfatin作用24h增高IL-6和TNF-α水平具有显著性(P<0.01),经统计学处理两组间差异无显著性；与对照组相比,100gg/L的visfatin作用6、12h对HUVEC上清液中的IL-6和TNF-α水平无明显增高,作用24、48h均能诱导其表达增高(P<0.05或P<0.01),经统计学处理两组间差异无显著性。2.DXR含药血清、SB203580、SP600125对HUVEC上清液中的IL-6和TNF-a含量的影响与对照组比,visfatin组和visfatin+空白血清组HUVEC培养上清IL-6和TNF-a表达显著增高(P<0.01)；与visfatin组比,DXR药物血清、SB203580、SP600125均可显著性的抑制由visfatin诱导的IL-6和TNF-a表达(P<0.05或P<0.01)。结论：visfatin能诱导HUVEC分泌IL-6和TNF-a增加,从而损伤HUVEC功能,DXR含药血清、SB203580、SP600125可以抑制visfatin诱导的HUVEC对IL-6和TNF-a的分泌,保护HUVEC功能。机制有可能与激活了P38MAPK及JNK通路有关。第三章P38MAPK及JNK通路在visfatin诱导HUVEC细胞损伤的作用及定心方含药血清的干预目的：结合前两章,研究visfatin的促炎症反应作用及其机制是否受P38MAPK及JNK信号通路的调节。结合前两章,研究定心方是否通过P38MAPK及JNK信号通路来减弱visfatin促炎症反应过程。方法及分组：visfatin时间梯度与浓度梯度分组同第一章。DXR含药血清及相关的通路抑制剂预处理细胞分组同第一章。Western blot法检测p38MAPK及JNK通路蛋白的表达,HUVEC按实验分组处理完成后,以Western及IP细胞裂解液提取HUVEC蛋白,BCA法进行蛋白定量,进行蛋白印迹实验。以β-actin为内参,将处理好的蛋白质样品进行SDS-PAGE分离,电泳结束后将蛋白质转移到PVDF膜上,封闭后,孵育一抗和二抗,ECL显色,KODAK Image Station2000MM成像系统采集图像,获得图像用图像处理软件Image Tool3.0测定并分析条带灰度值。结果：1.不同浓度及时间visfatin对HUVEC中p-p38MAPK、p-JNK及总p38MAPK、总JNK蛋白表达的影响与对照组相比,50μg/L visfatin作用24h对HUVEC中p-JNK的表达无明显升高,100、200visfatin作用24h能显著增高HUVEC中p-p38MAPK、p-JNK的表达(P<0.05或P<0.01),经统计学处理两组间无显著性差异：100gg/L的visfatin于6、12h HUVEC中的p-p38MAPK、p-JNK的表达无明显升高,而在24、48h均可显著增高p-p38MAPK、p-JNK的表达(氏0.01),经统计学检查两组间无显著性差异。2.DXR含药血清、SB203580、SP600125.对HUVEC中p-p38MAPK、p-JNK及总p38MAPK、总JNK蛋白表达的影响与对照组相比,visfatin组和visfatin+空白血清组的细胞p-p38MAPK、p-JNK蛋白表达能显著性可升高(P<0.05)；与visfatin组比,DXR含药血清和SB203580、SP600125能显著性的抑制visfatin诱导的p-p38MAPK、p-JNK表达(P<0.01)。结论：结合前两章结论可知,visfatin可抑制HUVEC的增殖并诱导HUVEC分泌IL-6和TNF-a增加,其机制与促进p38MAPK及JNK磷酸化有关。DXR含药血清通过受p38MAPK及JNK通路调节减少visfatin诱导的]HUVEC分泌IL-6和TNF-α,保护visfatin诱导的HUVEC的损伤。全文总结：visfatin促炎作用机制与促进HUVEC中JNK、P38MAPK的磷酸化有关,DXR含药血清通过调节p38MAPK及JNK通路保护visfatin诱导的HUVEC的损伤。