目的：类风湿关节炎（Rheumatoid arthritis, RA）是一种慢性炎症性疾病，其病因及发病机制尚不明确，主要侵犯滑膜组织，可导致进行性关节破坏。以TNF-α抑制剂为代表的生物制剂是近年来RA治疗学的重要进展，为RA的治疗提供了新的靶向治疗选择。但生物制剂并不能完全控制RA病情进展，临床缓解率仍不理想。同时，由于价格昂贵及可能出现严重不良事件，临床应用受到一定限制。近年研究提示植物药有效成分可能对RA骨破坏有治疗作用。本课题拟通过建立胶原诱导关节炎（collagen-induced arthritis, CIA）模型，采用流式细胞分析术检测外周血CD4+CD25+Foxp3+调节性T细胞（Regulatory T cells，Treg），ELISA法检测血清白介素-10（Interleukin-10，IL-10）、转化生长因子-β1(Transforminggrowth factorβ1，TGF-β1)、白介素-17（Interleukin-17，IL-17）含量，免疫组织化学法检测关节组织IL-10、TGF-β1与MMP3表达，探讨RA骨破坏的部分骨免疫学机制，同时观察植物药雷公藤多苷加人参皂苷配伍对实验性关节炎炎症评分及骨破坏相关因素的影响，为传统中药有效成分配伍治疗RA提供依据。方法：选择体重150-180g的Wistar大鼠，雌雄各半。电子称重，测量双侧足爪厚度，随机分为正常对照组和CIA造模组（实验组）。实验组大鼠于尾根部、右足跖及背部多处皮内注射鸡II型胶原共0.2ml/只，第14d加强免疫建立CIA模型。正常对照组用同样方法注入等量生理盐水。造模后第21d将成模大鼠随机分为模型组、雷公藤多苷组（TG）、TG+人参皂苷组（GS）、甲氨蝶呤组（MTX），每组8只。正常对照组和模型组予生理盐水灌胃，其他组分别给予TG、TG+GS、MTX灌胃治疗，共21d。造模后第42d测量各组大鼠体重、足爪厚度及关节炎指数；然后眼眶采血，抗凝，分离外周血单个核细胞，采用流式细胞分析术检测Treg。10%水合氯醛腹腔麻醉，腹主动脉取血留取血清，采用酶联免疫吸附（ELISA）法检测血清TGF-β1、IL-10、IL-17水平。同时取双侧踝关节，经固定、脱钙、常规梯度脱水、浸蜡、包埋、切片。HE染色后光镜下观察组织切片病理改变；免疫组化法检测踝关节滑膜组织TGF-β1、IL-10、MMP-3的表达并进行半定量分析。统计学处理：所有数据均采用SPSS13.0软件包进行统计学处理，所得结果以均数±标准差（±s）表示。各组间均数比较采用单因素方差分析（one-way ANOVA），采用LSD法进行组间两两比较。相关性分析采用Pearson相关检验。均以P<0.05认为有统计学意义。结果：1.各组大鼠一般情况的观察比较造模前各组体重差异无统计学意义（P>0.05）。造模后第21天，各组大鼠体重（g）分别为正常组186.88±5.87、模型组175.63±5.48、TG组175.64±6.30、TG+GS组180.00±6.41、MTX组176.88±7.94；模型组、TG组、TG+GS组、MTX组大鼠体重明显低于正常组，差异有统计学意义（P<0.05）；但模型组、TG组、TG+GS组、MTX组组间体重比较无统计学差异（P>0.05）。给药3周后，各组大鼠体重（g）分别为正常组207.88±6.98、模型组181.88±4.76、 TG组185.88±5.11、 TG+GS组199.50±5.40、MTX组188.25±7.36；模型组、TG组、TG+GS组、MTX组的大鼠体重低于正常组，差异有显著性（P<0.01）。与模型组相比，TG+GS组和MTX组大鼠体重差异有统计学意义（P<0.05）；但TG+GS组体重明显高于MTX组，差异有显著性（P<0.01）。造模后第21天，与正常组大鼠体重增加值（g）23.50±8.12相比，模型组13.50±7.29、TG组10.00±3.59、TG+GS组15.25±9.48、MTX组12.63±9.23差异有统计学意义（P<0.05）；与模型组相比，TG组、TG+GS组、MTX组体重增加值差异无统计学意义（P>0.05）。造模后第42天，与模型组6.25±2.43相比， TG+GS组19.50±4.24、MTX组11.38±3.07体重增加值差异有统计学意义（P<0.05），TG组10.25±5.23体重增加值差异无统计学意义（P>0.05）。2.各组大鼠关节炎指数的变化随着造模时间的延长，除正常对照组，各组大鼠关节红肿逐渐加重，关节炎指数逐渐增高。造模后第21天，与模型组9.88±0.83相比， TG组9.63±1.06、TG+GS组9.87±1.25、MTX组9.25±1.04关节炎指数差异无统计学意义（P>0.05）。造模后第42天，与模型组10.00±1.31相比，TG组4.88±1.13、TG+GS组4.75±1.49、MTX组4.63±1.06关节炎指数差异有统计学意义（P<0.01）；TG+GS组关节炎指数高于MTX组，但二者差异无统计学意义（P>0.05）。3.各组大鼠双足爪肿胀抑制率的变化灌胃结束后造模侧（右足）平均肿胀率（%）分别为：模型组51.75±7.27、TG组47.13±7.88、TG+GS组34.88±9.33、MTX组35.88±11.09，与模型组相比，TG+GS组、MTX组右足肿胀率差异有统计学意义（P<0.01）；与MTX组相比，TG+GS组对造模侧足爪肿胀的肿胀抑制率较好，但差异无统计学意义（P>0.05），TG组对造模侧足爪肿胀的抑制率较差，差异有统计学意义（P<0.05）。灌胃结束后非造模侧（左足）平均肿胀率（%）分别为模型组52.25±7.15、TG组47.75±7.48、TG+GS组36.50±8.05、MTX组35.38±10.80，与模型组相比，TG+GS组、MTX组右足肿胀率差异有统计学意义（P<0.01）；与MTX组相比，TG+GS组对造模侧足爪肿胀的抑制率较好，但差异无统计学意义（P>0.05），TG组对造模侧足爪肿胀的抑制率较差，差异有统计学意义（P<0.01）。4.各组大鼠PBMC中Treg的变化各组大鼠PBMC中CD4+CD25+Tregs细胞百分比分别为：正常组9.08±0.21、模型组5.38±0.27、TG组7.93±0.17、TG+GS组8.26±0.28、MTX组8.19±0.24，与正常组相比，模型组、TG组、TG+GS组、MTX组CD4+CD25+Tregs细胞百分比值差异具有统计学意义（P<0.01）；与模型组相比，TG组、TG+GS组、MTX组CD4+CD25+Tregs细胞百分比值差异具有统计学意义（P<0.01）；与MTX组相比， TG+GS组CD4+CD25+Tregs细胞百分比值较高，但差异无统计学意义（P>0.05），TG组CD4+CD25+Tregs细胞百分比值差异有统计学意义（P<0.05）。各组大鼠CD4+CD25+Foxp3+Tregs细胞百分比分别为：正常对照组4.59±0.58、模型组2.71±0.20、TG组3.80±0.32、TG+GS组4.46±0.40、MTX组4.18±0.25，与正常对照组相比，模型组、TG组、MTX组CD4+CD25+Foxp3+Tregs细胞百分比值差异有统计学意义（P<0.05），TG+GS组CD4+CD25+Foxp3+Tregs细胞百分比值较正常组低，但无统计学意义（P>0.05）；与模型组相比，TG组、TG+GS组、MTX组CD4+CD25+Foxp3+Tregs细胞百分比值差异有统计学意义（P<0.01）；与MTX组相比，TG+GS组CD4+CD25+Foxp3+Tregs细胞百分比值较高，但差异无统计学意义（P>0.05）、TG组组CD4+CD25+Foxp3+Tregs细胞百分比值差异有统计学意义（P<0.05）。5.各组大鼠血清TGF-β1、IL-10、IL-17的变化5.1血清TGF-β1（pg/ml）水平比较与正常组（609.86±100.93）相比，模型组（412.64±87.26）TGF-β1水平差异有统计学意义（P<0.01），TG组（518.68±152.93）、TG+GS组（596.60±148.59）、MTX组（587.45±107.06）差异无统计学意义（P>0.05）。与模型组相比，TG+GS组、MTX组TGF-β1水平差异有统计学意义（P<0.01）。TG+GS组TGF-β1水平高于MTX组，但差异无统计学意义（P>0.05）。5.2血清IL-10（pg/ml）水平比较与正常组（54.92±8.81）相比，模型组（37.88±12.14）、TG组（40.60±11.45）IL-10水平差异有统计学意义（P<0.05），TG+GS组（51.28±11.58）、MTX组（49.35±14.59）差异无统计学意义(P>0.05)。与模型组相比，TG+GS组IL-10水平差异有统计学意义（P<0.05），TG组和MTX组差异无统计学意义(P>0.05)。5.3血清IL-17（pg/ml）水平比较与正常组（31.24±9.20）相比，模型组（52.48±17.07）IL-17水平差异有统计学意义（P<0.01），TG组（42.67±11.26）、TG+GS组（37.77±10.60）、MTX组（38.52±15.49）差异无统计学意义（P>0.05）。与模型组相比，TG+GS组、 MTX组IL-17水平差异有统计学意义（P<0.05）,TG+GS组IL-17水平低于MTX组，但差异无统计学意义（P>0.05）。5.4外周血Treg细胞水平与血清TGF-β1、IL-10、IL-17和关节炎病理积分的相关性Treg与TGF-β1、IL-10存在正相关关系（r=0.488，0.425，P<0.01），Treg与IL-17和关节炎病理评分存在负相关关系（r=-0.423，-0.360，P<0.05）。6.各组大鼠踝关节病理变化病理结果显示，正常对照组大鼠踝关节未见明显病变。模型组大鼠滑膜细胞增生，滑膜组织炎细胞浸润，滑膜衬里层增厚；滑膜与软骨连区域滑膜细胞增生，软骨损伤；骨小梁变细，软骨下骨和小梁骨出现骨侵蚀，破坏严重。各用药组病理改变较模型组轻。与模型组（2.00±0.76）相比，TG+GS组（1.00±0.76）、MTX组（1.13±0.83）病理积分差异有统计学意义（P<0.05），TG组（1.25±0.71）差异无统计学意义（P>0.05）。7.各组大鼠踝关节TGF-β1、IL-10、MMP-3表达的变化与正常组（0.18±0.02）相比，模型组（0.30±0.03）、TG组（0.22±0.04）关节滑膜组织中TGF-β1表达差异有统计学意义（P<0.05），TG+GS组（0.19±0.03）、MTX组（0.20±0.04）差异无统计学意义（P>0.05）。TG+GS组TGF-β1表达最少，但与MTX组相比差异无统计学意义（P>0.05）。与正常组（0.23±0.04）相比，模型组（0.11±0.01）、TG组（0.13±0.04）、MTX组（0.17±0.05）关节滑膜组织中IL-10表达差异有统计学意义（P<0.01），TG+GS组（0.20±0.03）差异无统计学意义（P>0.05）。TG+GS组IL-10表达最多，但与MTX组相比差异无统计学意义（P>0.05）。与正常组（0.28±0.07）相比，模型组（0.77±0.06）、TG组（0.60±0.12）、TG+GS组（0.50±0.12）、MTX组（0.46±0.09）关节软骨中MMP-3表达差异均有统计学意义（P<0.01）。MTX组MMP-3表达最少，但与TG+GS组相比差异无统计学意义（P>0.05）。结论：1胶原诱导关节炎大鼠CD4+CD25+Foxp3+Treg与血清TGF-β1、IL-10水平存在正相关关系，与血清IL-17、关节炎病理积分存在负相关关系，CD4+CD25+Foxp3+Treg通过上调血清TGF-β1、IL-10的水平增强其免疫调节作用，对类风湿关节炎骨破坏具有保护作用。2雷公藤多苷联合人参皂苷可能通过升高CD4+CD25+Foxp3+Treg、TGF-β1、IL-10，降低IL-17水平，减少滑膜组织中TGF-β1及关节软骨组织中MMP-3的表达，增强滑膜组织中IL-10表达，而对CIA大鼠具有骨保护作用。此外，也可能通过调节Treg/Th17之间的平衡发挥免疫抑制作用。3雷公藤多苷联合人参皂苷在升高CD4+CD25+Foxp3+Treg及免疫调节性细胞因子（TGF-β1、IL-10），降低促炎细胞因子（IL-17）及软骨降解酶（MMP-3）方面的作用，进一步证实了它们在抗炎、骨保护方面的作用，从而为RA的治疗提供了新思路、新方法。