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目的:全世界43.7%的肝癌患者在中国,严重威胁着我国人民的健康。原发性肝癌发病比较隐匿,临床诊疗中存在早期诊断难、复发转移率高、治疗缺乏针对性、治疗手段少等问题。因此对肝癌诊治新技术、新疗法的研究尤为重要和迫切。光动力疗法(Photodynamic therapy,PDT)作为一种新的肿瘤治疗方法已应用于临床,对体表和脑内肿瘤等取得了比较理想的治疗效果,但对肝脏肿瘤等腹腔内肿瘤的相关研究较少。本实验拟在初步探讨photosan—PDT在不同实验条件下对人HepG2肝癌细胞增殖的抑制作用并初步探讨其作用机制,以期为PDT成为肝癌治疗新方法提供进一步的理论依据。内容:将体外培养的人HepG2肝癌细胞常规传代后,在无光照情况下,比较不同浓度光敏剂—photosan对肝癌细胞增殖的影响,然后以photosan为光敏剂、半导体激光器(波长630nm)为光源进行激光照射,在不同浓度光敏剂经不同剂量的光照后,用MTT法测定PDT后HepG2肝癌细胞的残存率,并用流式细胞分析检测PDT对肝癌细胞周期的影响,以Annexin V-FITC/PI检测细胞凋亡。方法:HepG2肝癌细胞复苏,常规培养并传代。实验主要分四部分:(1)无光照情况下,不同浓度光敏剂对肝癌细胞增殖的影响。将细胞按实验设计转移至96孔板,常规培养,细胞贴壁后,加入不同浓度的光敏剂,使B2至G2为空白对照,既不加细胞也不加光敏剂,只加培养基;B3至G3为实验对照,只加细胞不加光敏剂;B4至G11的矩形区域为光敏剂实验组,按列分别加入2,4,6,8,10,12,14,16mg/L的光敏剂,孵育4h后,弃去光敏剂,继续孵育24h,进行MTT比色实验。(2)在激光照射下,比较不同浓度光敏剂及不同光剂量对肝癌细胞残存率的影响,并粗略比较在光剂量一定的情况下,激光强度对肝癌细胞残存率的影响。将细胞按实验设计转移至96孔板,常规培养,细胞贴壁后,加入不同浓度的光敏剂,为照光方便,每板只接受一种浓度光敏剂(6mg/L或10mg/L)。孵育4h后,弃去光敏剂,进行激光照射。为照光方便,每板只接受一种激光强度(30mW/cm~2或50mW/cm~2),调整照光时间,使D2、D4、D6、D8、D10、F2、F4、F6、F8、F10孔分别接受2,4,6,8,10,12,14,16,18,20J/cm~2的光剂量。B2至B4为空白对照,B5至B7为实验对照,B8至B10为光敏剂实验组。照光后继续孵育24h,进行MTT比色实验。相同的实验重复六次。(3)流式细胞分析检测细胞周期。肝癌细胞行PDT处理后,继续孵育24h,常规消化处理培养细胞,收集细胞,以标准程序进行流式细胞分析,结果用细胞周期拟合软件进行分析。(4)Annexin V-FITC/PI检测细胞凋亡。肝癌细胞行PDT处理后,继续孵育24h,常规消化处理培养细胞,依照Annexin V-FITC/PI双染试剂盒染色说明检测细胞凋亡。结果:(1)MTT结果显示,无光照情况下,不同浓度光敏剂对肝癌细胞的增殖不产生明显影响(P＞0.05)。(2)MTT结果显示PDT对HepG2肝癌细胞有很强的抑制作用,在一定范围条件下,随着光敏剂浓度及激光剂量的增加,细胞残存率明显下降(P＜0.05);在光剂量大于12J/cm~2后细胞残存率下降趋于缓和甚至不再产生明显下降(P＞0.05)。此外,在光敏剂浓度及激光剂量一定的情况下,30mW/cm~2的激光强度似乎比50mW/cm~2的效果更优。(3)流式细胞分析显示PDT后肝癌细胞周期被阻滞于G1、G2期,正常的细胞复制被阻断。(4)AnnexinV-FITC/PI检测发现PDT诱导了明显的细胞凋亡。结论:体外实验显示:PDT对HepG2肝癌细胞有很强的抑制作用,在一定的范围条件下,随着光敏剂浓度及激光剂量的增加,抑制作用明显增强。这种抑制作用可能由于PDT后正常的肝癌细胞复制周期被阻断导致细胞凋亡而引起的。