论文部分内容阅读
诱导多能性干细胞(induced pluripotent stem cells,iPSCs)，是指将特定转录因子导入分化的体细胞，使其被重编程为具有多能性状态，类似于ES细胞的多能性干细胞。本研究探讨了将穿膜肽与转录因子进行融合表达，以建立一种非转基因生产水牛iPSCs的方法。本试验通过PCR亚克隆了水牛的四个iPS细胞转录因子(Oct4、Sox2、cMyc、Klf4)，构建了原核表达载体，并对目的蛋白进行了纯化，结果如下：
1、根据NCBI上检索到的HA2（流感病毒血凝素2蛋白）和TAT(HIV病毒转录活化因子)序列，人工合成了优化的HA2-TAT，然后连接到原核表达载体pET-32a(+)上，成功改造为基础表达载体pET-HA2-TAT。
2、通过PCR亚克隆水牛的四个iPS细胞转录因子(Oct4、Sox2、cMyc、Klf4)，并定向克隆到pET-HA2-TAT，成功构建了原核表达载体pET-NLS-Oct4-TAT、pET-NLS-Sox2-TAT、pET-NLS-cMyc-TAT、pET-NLS-KIf4-TAT。
3、将原核表达载体转化宿主菌BL21(DE3)或Transetta(DE3)，诱导表达了目的蛋白：NLS-Oct4-TAT蛋白(61.4kDa)、NLS-Sox2-TAT蛋白(57.7kDa)、NLS-cMyc蛋白(71.6kDa)，并优化了各自的表达条件和纯化条件。
4、构建了pET-EGFP、pET-NLS-EGFP-TAT载体，表达并纯化了EGFP蛋白和NLS-EGFP-TAT蛋白，添加入小鼠成纤维细胞培养液中，初步验证了融合蛋白具有细胞穿膜功能。
结论：构建了四个融合穿膜肽的水牛iPSCs转录因子表达载体，其中三个能够顺利表达目的蛋白，并优化了各自的表达条件和纯化条件；利用EGFP蛋白初步验证了融合有TAT的目的蛋白具有细胞穿膜功能。