枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）是重要的工业菌株,也是饲料添加剂品种目录中可直接饲喂动物的微生物添加剂菌种,具有拮抗病原菌、调节肠道菌群、提升机体免疫力、改善生产性能等作用。目前以枯草芽孢杆菌及细菌素为主要成分的微生态制剂作为饲用抗生素替代品被广泛使用。然而,菌株同质化、功能不明确、机制不清楚等问题导致产品功效不显著、质量不稳定。因此挖掘枯草芽孢杆菌益生特性、深入剖析其作用机制,能够为其合理应用提供理论依据。菌株LF-11是本实验室从青贮饲料中筛选的一株枯草芽孢杆菌,前期对该菌株与另外一株益生菌枯草芽孢杆菌的功能基因的比较分析表明,菌株LF-11基因组中含有更多的功能基因参与细胞生物合成、信号转导、物质代谢、翻译后修饰等生理功能;体外研究也表明该菌株能够分泌大量消化酶、拮抗病原菌,具有良好的黏附特性。本论文以探究B.subtilis LF-11的益生机制和鉴定抗菌产物为目标,在注释和解析其全基因组信息的基础上,挖掘与菌株益生作用和细菌素合成相关的功能基因;通过分离纯化及结构分析,鉴定该抗菌物质,并对纯化的细菌素性质和杀菌机制进行探究;通过培养条件优化,提高其产量;通过肉鸡饲喂试验和体外肠上皮细胞培养,探究该菌株保护肉鸡抵抗沙门氏菌感染的作用机制,为该菌株的工业化应用奠定基础。具体取得的标志性成果如下:1.基于功能基因组分析,挖掘B.subtilis LF-11编码的细菌素基因簇分析和表征 B.subtilis LF-11编码的功能基因,有助于阐明其益生功能并开发新产品。本研究在B.sutilis LF-11的全基因组测序的基础上,按照GO以及KEGG数据库中的标准对功能基因进行归类分析。采用antiSMASH软件在B.subtilis LF-11基因组上预测到6类共10个编码次级代谢产物的基因簇,使用BAGEL 4预测经核糖体途径合成和翻译后修饰的多肽（RiPPs）的基因簇,4个潜在的热点区域（Areas of interest,AOI）分别编码1个群体感应信号分子和3个潜在的细菌素;这些代谢产物在杀菌、促免疫、抗胁迫、代谢调控等生理过程中发挥重要作用。同时发现,B.subtilis LF-11基因组上含有大量与生理调控相关的基因,提示该菌株对各种环境压力如氧化、温度、胆盐、pH等具有耐受性。此外还存在与黏附、聚集等相关的基因,表明该菌株在肠道定植、病原菌拮抗、提供特殊营养元素等方面具有优势。这些结果预示该菌株具有潜在益生特性,为其表型特性研究奠定了基础。2.B.subtilis LF-11抗菌物质的分离纯化、鉴定及性质分析测定B.subtilis LF-11在LB培养基中的生长动力学曲线,发酵液在对数生长期出现抑菌活性,稳定期达到最大。收集稳定期发酵液,经过硫酸铵沉淀、离子交换层析、凝胶过滤层析和RP-HPLC等步骤后,抑菌活性成分纯度达到98.7%。一级质谱分析确定其分子量为3.4 kDa,二级质谱分析到的氨基酸片段与基因组数据比对鉴定该细菌素为subtilosin A,将其命名为subtilosin A-11。性质研究表明,subtilosin A-11经胃蛋白酶或胰蛋白酶处理2 h后,其抑菌活性仍分别保留（95.8±1.4）%和（96.6±1.6）%;在pH 4-10范围内活性损失不显著;80℃处理30 min后,抑菌活性仍保留（89.5±3.5）%,表明subtilosin A-11能够耐受消化道蛋白酶,在一定温度和pH环境下仍能发挥抑菌作用。此外,对常见食品腐败菌或病原菌有较强抑菌活性,且具有良好的生物安全性,提示subtilosin A-11具有良好的应用潜力。3.Subtilosin A-11抑菌机制分析细菌素作用机制的阐明可为其实际应用提供理论依据。本研究分别以食源性病原菌单增李斯特菌ATCC 19114和奶牛乳腺炎致病菌无乳链球菌ATCC 13813为指示菌,研究了 subtilosin A-11的抑菌机制。首先,测定subtilosin A-11对单增李斯特菌ATCC 19114的最小抑菌浓度（MIC）和最小杀菌浓度（MBC）分别为1.9 mg/L和3.9mg/L;对无乳链球菌ATCC 13813的MIC和MBC分别为250 mg/L、500 mg/L。绘制subtilosin A-11对指示菌的杀菌曲线,发现subtilosin A-11对单增李斯特菌ATCC 19114的杀菌作用有浓度依赖性,对无乳链球菌ATCC 13813有时间依赖性。扫描电子显微镜（SEM）观察发现,1×、2×及4×MIC浓度的subtilosin A-11使单增李斯特菌ATCC 19114分别出现表面褶皱且出现囊泡、形成不规则孔洞和菌体破裂的现象,使无乳链球菌ATCC 13813菌链的两端形成半球形的孔洞,中间球菌由规则的圆球变为橄榄球状。进一步分析发现,高浓度的subtilosin A-11造成指示菌通透性破坏、质子动力势崩解和胞内ATP含量的快速下降;低浓度subtilosin A-11导致指示菌细胞膜通透性增大、质子动力势消散和胞内ATP减少的明显延迟。荧光显色进一步证实subtilosin A-11对单增李斯特菌ATCC 19114和无乳链球菌ATCC 13813的杀菌作用分别具有浓度依赖性和时间依赖性。4.Subtilosin A-11 的过量生产利用单因素实验优化了 B.subtilis LF-11高产subtilosin A-11的条件,初步确定培养基组分为糖蜜15 g/L、甘油10 mL/L、酵母粉30 g/L和NaCl 5 g/L,培养条件为温度35℃、转速150 rpm、培养基初始pH 7.5。采用Plackett-Burman试验、Box-Behnken设计进一步确定最佳培养基组成和培养条件,得到最佳培养基组成为:酵母粉41 g/L,甘油 14.6 mL/L,糖蜜 15 g/L,NaCl 5 g/L;在初始 pH 7.5、温度 35℃、转速 142 rpm条件下,subtilosinA-11产量达到328.8 mg/L,较初始培养条件提高了 48倍,是目前已报道subtilosin A产量的最高水平。同时发现,当芽孢大量生成时,subtilosin A积累达到最大量,因此,工业生产上可以利用芽孢生成率表征subtilosin A-11合成进程。通过对NaCl沉淀法和酸沉淀法的正交试验,简化了 subtilosin A-11的制备工艺,为其工业化产生奠定了基础。5.B.subtilis LF-11在预防肉鸡感染沙门氏菌中的应用及保护机制抑菌活性测定表明,B.subtilis LF-11对单增李斯特菌、无乳链球菌等革兰氏阳性病原菌有抑制作用,但不抑制沙门氏菌、大肠杆菌等革兰氏阴性菌。肉鸡饲喂试验表明,B.subtilis LF-11能有效预防肉鸡沙门氏菌感染,使腹泻率和死亡率分别降低63%和37%。为探明该菌株对肉鸡的保护机制,以肠上皮细胞NCM460为模型,将B.subtilis LF-11和沙门氏菌H9812菌体分别以排斥和竞争的方式与细胞NCM460共孵育。结果表明,B.subtilis LF-11能有效阻碍沙门氏菌H9812对NCM460细胞的黏附和侵染,以排斥的方式使黏附和侵染的沙门氏菌数量分别降低了 47.4%和81.1%,以竞争的方式分别降低了 33.1%和61.7%。两种作用方式下,肠上皮细胞存活性分别提高了（105.5±2.33）%和（56.98±5.74）%。同时,RT-PCR 和 western blot 分析证实,B.subtilis LF-11 使肠上皮细胞NCM460的紧密连接蛋白相关基因CLDN-1、OCLN、JAM-1和ZO-1的转录和表达水平上调。免疫荧光强度观察进一步表明紧密连接蛋白的分布更加均匀。此外,RT-PCR分析表明,在排斥试验中NCM460细胞的促炎基因IL-6、IL-8、TNF-α的转录水平分别下调了 50.7%、49.7%和11.7%,ELISA分析也证实了 IL-8的分泌量明显降低。以上实验结果表明,B.subtilis LF-11通过降低沙门氏菌H9812对肠上皮细胞的侵染、强化黏膜屏障同时弱化炎症反应而发挥益生作用,益生机制的阐明为该菌株的工业化生产和应用提供了理论参考。