联合用药是提高抗肿瘤治疗效果和克服肿瘤耐药的重要临床措施。与联合用药相比,多靶点药物在发挥类似活性的同时,还能有效避免不良的药物-药物相互作用和提高病人依从性,因此是药物化学研究领域的热点之一。肿瘤的侵袭和转移是恶性肿瘤难以被治愈的原因之一,许多研究表明氨肽酶N（Aminopeptidase N,APN）可以降解细胞外基质（extracellular matrix,ECM）进而促进肿瘤转移。此外,大量研究表明,APN的异常表达与多种癌症的发生发展密切相关。因此APN被视为癌症治疗的重要靶点。PI3K/AKT信号通路是调控细胞增殖、细胞周期和细胞凋亡的重要信号通路,同时也是人类癌症中最常见的被激活的信号通路之一。蛋白激酶B（Protein kinase B,AKT,PKB）在PI3K/AKT信号通路起关键作用,因此也是癌症治疗的重要靶点。近年来,有许多研究表明在一些实体瘤细胞中,APN抑制剂和AKT抑制剂具有良好的协同作用。比如在黑色素瘤和骨肉瘤细胞中,APN抑制剂bestatin与AKT抑制剂联合使用抑制效果更佳。此外bestatin还可以通过抑制CD13/EMP3/PI3K/AKT/NF-κB信号通路的激活来克服胃癌细胞对顺铂（Cisplatin,CDDP）的耐药性。因此,APN/AKT双靶点抑制剂有望发挥比单靶点药物更强的抗癌活性。我们根据APN抑制剂bestatin和AKT抑制剂AZD5363的药效团,利用分子杂化原理,设计合成了两个系列,共19个结构新颖的APN和AKT双靶点抑制剂,并分别对目标化合物进行体外活性测试。体外APN抑制实验结果表明,大部分化合物对APN表现出较好的体外抑制活性。具体来说,化合物（S）-5a、（S）-5b、（S）-5c、（S）-5d、（S）-5e、（R）-5f、（R）-5g、（R）-5h、（R）-5j、10a、10b、10c、10d、10e、10f、12a和12b活性均优于阳性对照bestatin,其中化合物12b活性格外突出（IC50=0.05μM）,比bestatin（IC50=3.64 μM）强70余倍。同时通过实验结果也发现R基团为R构型时对活性贡献更大,在随后的结构优化中,我们选取了R构型的氨基酸作为侧链。体外AKT1抑制实验结果表明部分化合物显示出较好的AKT1抑制活性,其中化合物（R）-5f和（R）-5h对AKT1的IC50值分别为0.12 μM和0.27 μM。值得指出的是,化合物（R）-5h对APN和AKT1两个靶点表现出较为均衡的抑制活性（IC50值分别为0.27 μM和0.21 μM）。抑制人脐静脉内皮细胞（HUVECs）成管腔实验验证了化合物（R）-5f和（R）-5h在细胞水平也具有优秀的APN抑制活性,其抑制HUVECs成管腔活性明显优于阳性对照bestatin。而Western Blot的结果表明,化合物（R）-5h能剂量和时间依赖性的降低胞内AKT底物GSK3β的磷酸化水平。随后,我们选取了 MDA-MB-468和AGS细胞株进行体外抗增殖活性的研究,但是大部分目标化合物均未表现出显著的抗增殖活性。最后,我们用分子对接模拟了化合物（R）-5h与APN和AKT1的结合模式,结果表明代表性化合物（R）-5h能很好的占据APN的活性位点和AKT1的ATP 口袋,这既为其双靶点抑制活性提供了支持,又为后续对化合物进一步结构优化以提高活性提供了 一定的依据。