在上世纪八十年代，科学家们发现神经系统有合成甾体的能力，进而提出了神经活性甾体的概念。神经活性甾体(neuroactive steroids，NASs)是天然存在或者人工合成的在神经组织具有活性的所有甾体激素的统称。神经活性甾体对神经系统的功能活动有着广泛的调节作用。神经活性甾体与神经元兴奋毒性死亡、凋亡有着密切的关系，并对学习记忆有着重要的影响。 随着社会的老龄化，阿尔茨海默氏病(Alzheimer’s Disease，AD)、帕金森氏病(Parkinson’s Disease，PD)、脑缺血等疾病的发病率呈上升趋势，这类疾病严重威胁着人们的生命健康并往往伴随着神经元的丧失和学习记忆能力的下降。目前，这类疾病尚没有理想的治疗方法。实验表明体内某些甾体激素的水平与此类疾病的发生发展有关。神经活性甾体的替代疗法已运用于临床，如雌激素用于AD的治疗。但是这些甾体的副作用问题也比较突出。因此，深入研究神经元凋亡的机制，并寻找作用特异、保护效果好、副作用小的甾体药物是努力的方向之一。 海洋甾体(又称甾醇类化合物)是源于海洋生物体内的一大类重要的天然化学成分，它们许多独特的结构是陆生生物体内所没有的。迄今为止对海洋甾体的研究重点涉及溶血、抗炎、细胞毒和抗肿瘤、抗菌、抗真菌、抗病毒等药理特性。本实验室的前期研究表明，从南沙群岛唇软珊瑚中提取的四羟基甾醇(氧代固醇)类化合物YC-1能够抑制低钾诱导的小脑颗粒神经元凋亡，这是首次报道海洋甾体具有神经保护作用。然而，由于YC-1从南沙群岛唇软珊瑚等少数海洋生物中提取得到，采集不易和越来越严格的海洋环境保护使其来源十分有限，而且YC-1在这些生物体内的含量极微，加上提取步骤烦琐低效，造成天然品YC-1的纯度有限、成本相当昂贵，难以实现工业化生产，大大阻碍了对YC-1药理学机制的深入研究。目前，本实验室以廉价的猪去氧胆酸为原料，通过化学合成的方法得到了YC-1及其类似物YC-5。本文丰要是探讨化学合成的海洋甾体YC-1和YC-5在体外细胞水平对神经元兴奋性毒性损伤的保护作用，及其对癫痫发生的影响，并对它们的作用机制进行了初步探讨，同时希望能为海洋甾体作用机制的阐明和防治中枢神经系统损伤的新药开发提供线索和帮助。本章建立了谷氨酸诱导的小脑颗粒和皮层神经元的兴奋性毒性损伤模型，观察人工合成的海洋甾体YC-1和YC-5对谷氨酸引起的神经兴奋性毒性有无保护作用，并从细胞内钙浓度和细胞膜Ca2+内向电流的变化探讨其可能机制。 方法：大鼠小脑颗粒神经元和皮层神经元的分离和原代培养；相差显微镜(phase contrast microscopy)观察神经元的胞体及突起形态变化；Hoechst 33258染色观察神经元胞核及染色质的形态变化；二乙酸荧光素(fluorescein diacetate，FDA)染色检测神经元的代谢活性(metabolic activity)和存活率(viability)；LDH释放实验测定细胞的损伤程度；Confocal测定细胞内Ca2+浓度变化和全细胞膜片钳技术测定细胞膜Ca2+电流的变化来探讨YC-1和YC-5的在谷氨酸诱导的神经元兴奋性毒性损伤中的作用机制；定量实验结果以-x±s表示，采用t检验和方差分析。 结果：FDA活细胞染色、Hoechst 33258核染色、LDH释放量的测定表明YC-1和YC-5能够抑制谷氨酸诱导的小脑颗粒和皮层神经元的兴奋性神经毒性。相同剂量下(10 μM)，YC-1的抑制效应要强于YC-5；YC-1和YC-5可以抑制谷氨酸引起的皮层神经元的胞内Ca2+浓度的增加，并可以抑制谷氨酸引起的皮层神经元细胞膜的Ca2+电流。 结论：化学合成的海洋甾体YC-1和YC-5能够抑制谷氨酸诱导的神经元兴奋性毒性损伤，这一作用可能是通过抑制NMDA受体激活，进而抑制其引起的胞内Ca2+浓度的增加来实现的。 本章建立了海人酸诱导的小脑颗粒和海马神经元的兴奋性毒性损伤模型，观察人工合成的海洋甾体YC-1和YC-5对海人酸引起的神经毒性有无保护作用，并从细胞内Ca2+浓度的变化探讨其效应的可能机制。 方法：大鼠小脑颗粒神经元和海马神经元的分离和原代培养；相差显微镜(phase contrast microscopy)观察神经元的胞体及突起形态变化；Hoechst 33258染色观察神经元胞核及染色质的形态变化；二乙酸荧光素(fluorescein diacetate，FDA)染色检测神经元的代谢活性(metabolic activity)和存活率(viability)；LDH释放实验测定细胞的损伤程度；Confocal测定胞内Ca2+浓度变化探讨YC-1在海人酸诱导的神经元兴奋性毒性损伤中的作用机制；定量实验结果以-x±s表示，采用t检验和方差分析。 结果： FDA活细胞染色、Hoechst33258核染色、LDH释放量的测定表明YC-1和YC-5能够抑制海人酸诱导的小脑颗粒和海马神经元的兴奋性神经毒性。相同剂量下(10 μM)，YC-1的抑制效应要强于YC-5；YC-1可以抑制海人酸引起的海马神经元胞内Ca2+浓度的增加。 结论：化学合成的海洋甾体YC-1和YC-5能够抑制海人酸诱导的神经元兴奋性毒性损伤，这一作用可能足通过抑制海人酸引起的非NMDA受体激活，抑制其引起的胞内Ca2+浓度的增加来实现的。 在前两章中，我们分别在谷氨酸和海人酸诱导的神经元兴奋性毒性损伤模型中观察了化学合成的海洋甾体YC-1和YC-5的保护作用，本章主要观察化学合成的海洋甾体YC-1脂质体对海人酸诱发的C57／BL小鼠癫痫的影响。 方法： KA腹腔注射造成小鼠癫痫模型；按照Racine's标准进行癫痫行为学评分；海马切片HE染色观察CA3区神经元丢失情况；Morris水迷宫实验观察小鼠癫痫后对认知的影响；海马切片Timm染色观察苔藓纤维发芽的情况。 结果： YC-1可延长海人酸诱导的C57／BL小鼠癫痫发作的潜伏期；YC-1可以减轻癫痫发作造成的C57／BL小鼠海马CA3区神经元丢失；YC-1可以缩短癫痫的C57／BL小鼠在水迷宫实验中搜索平台的时间，并可改善癫痫发作造成的搜索策略的改变；YC-1还可以减轻癫痫发作造成的C57／BL小鼠海马苔藓纤维发芽。 结论：化学合成的海洋甾体YC-1对海人酸诱发的小鼠癫痫具有一定的保护作用。