[目的]：　　建立液相色谱-串联质谱(liquid chromatography-tandem mass spectrometry，LC-MS/MS)分析组织全基因组羧甲基化水平方法，并用于分析SD大鼠不同器官基因组羧甲基化水平。应用实时荧光定量PCR检测羟化酶TET1(ten-eleventranslocation)表达水平的改变，寻找基因羧甲基化及羟化酶TET1表达在SD大鼠不同器官组织中的特点和联系，为研究基因羧甲基化在表观遗传过程的相关机理打下基础。　　[方法]：　　1.组织DNA的提取:按照不同公司的基因组DNA提试剂盒的操作说明分别提取SD大鼠基因组DNA，比较DNA的提取效果，运用琼脂糖凝胶电泳检测DNA的完整性并用紫外分光光度计进行DNA浓度以及纯度的检测，浓度和纯度合格的DNA用于下一步的分析。　　2.DNA羧甲基化LC-MS/MS分析条件优化:提取的DNA通过甲酸水解，并对色谱柱的选择、流动相的流速、比例、甲酸铵浓度、氨水浓度、质晰参数等进行优化考察。　　3.基因组羧甲基化的LC-MS/MS分析:提取SD大鼠不同组织的DNA，加入Cyt13C15N2，在氮气下吹干，加入88％甲酸在140℃反应90min进行水解，氮气吹干，用流动相复溶后离心，取上清液，用LC-MS/MS进行分析。　　4.TET1基因引物的设计:参照Genbank已公布的羟化酶TET1基因及内参基因GAPDH的mRNA序列，利用Primer5.0软件分别设计用于qRT-PCR的引物，通过在线blast工具进行检测引物的特异性，并运用Oligo7.0软件分析引物质量，筛选出合适的引物。　　5.组织RNA的提取:按照天根总RNA提取试剂盒的操作说明提取SD大鼠各组织RNA，运用琼脂糖凝胶电泳检测RNA的完整性，利用酶标仪对RNA的纯度及浓度进行测定。　　6.TET1表达水平的实时荧光定量PCR分析:取质量符合要求的RNA按照天根cDNA第一链合成试剂盒的操作说明进行反转录。逆转录产物经内参基因扩增检验其完整性，以质量符合的cDNA作为模板，荧光定量PCR条件为:95℃，变性，15s;60.0℃，延伸，30s;72.0℃，退火，30s;40个循环，在延伸阶段采集荧光信号，PCR结束后再60～95℃进行熔解曲线分析，最后分析TET1酶的表达水平。　　[结果]：　　1.方法优化　　1.1DNA提取:选择四家公司不同DNA提取试剂盒，比较DNA提取效果，发现天根和QIAGEN公司的基因组DNA提取试剂盒提取的的DNA条带单一、清晰、完整性较好，但天根公司的试剂盒性价比更高。　　1.2色谱条件选择:通过比较C18柱和HILIC色谱柱对5-羧基胞嘧啶(5-carboxylcytsine，5caC)和胞嘧啶(Cytosine，Cyt)的保留和分离，发现C18柱对5caC和Cyt没有保留，而HILIC色谱柱能较好分离5caC和Cyt。并对流动相比例、流动相氨水浓度、水相甲酸铵浓度和洗脱程序进行优化，发现以7mM甲酸铵，0.1％氨水的水相和0.1％氨水的乙腈为流动相，在梯度洗脱条件下5caC和Cyt能快速分离且峰形较好。　　1.3质谱条件选择:通过对5caC、Cyt和Cyt13C15N2进行扫描选择母离子和优化母离子的Fragment电压和子离子碰撞能量(CE)，发现5caC的母离子m/z156，子离子（m/z138.1和m/z94.9）;Cyt的母离子m/z112.1，子离子(m/z95.0和m/z69.0);Cyt13C15N2母离子m/z115.1，子离子（m/z97.2和m/z70.2）并在最佳Fragment和CE的条件下，5caC、Cyt和Cyt13C15N2灵敏度较高。　　2.基因组羧甲基化的LC-MS/MS分析方法验证:Cyt和5caC的线性范围分别为(400～4000) ng/mL和(1～100) ng/mL，其相关系数分别为0.9991和0.9981。Cyt和5caC的LOD分别为0.05 ng/mL和0.1 ng/mL，LOQ分别为0.1ng/mL和0.5ng/mL。Cyt和5caC的日内和日间RSD范围均在2.63％～6.26％，准确性范围在85％～105％和精密度RSD分别为3.90％和4.81％，Cyt和5caC加标回收率为86.27％～92.95％。特异性实验证实Cyt、5mC、5hmC、5fC单个标准或混合标准在酸性加热条件下没有生成5caC。　　3.LC-MS/MS分析不同器官的基因组羧甲基化水甲:以5caC与（5caC和Cyt之和)的摩尔浓度比表示羧甲基化率((x)±s)，结果发现不同器官的基因组羧甲基化水平范围在8.70×10-6～2.95×10-5，脑部羧甲基化的水平高于心、肝、肺和肾[(1.06±0.05)×10-5、（0.87±0.16)×10-5、（1.50±0.24)×10-5和（1.28±0.16)×10-5]的羧甲基化水平(p＜0.05)，而脑部的大脑、小脑和脑干[（2.63±0.14）×10-5、（2.51±0.15）×10-5和（2.95±0.17）×10-5，n=6]之间没有显著性差异(p＞0.05)。　　4.羟化酶TET1表达水平的实时荧光定量PCR分析:通过测定SD大鼠不同器官中羟化酶TET1表达水平，发现大脑TET1酶的表达高于心、肝、肺和肾[（0.587±0.042）％、（0.608±0.080）％、（0.839±0.035）％和（0.579±0.056）％](p＜0.05)，但脑部的大脑、小脑[（1.030±0.058）％]和脑干[(1.009±0.090)％]之间没有显著性差异(p＞0.05)。　　5.通过双变量关系统计分析了SD大鼠不同器官羧甲基化水平与TET1酶表达关系，发现两者具有正相关关系（r=0.940，p＜0.05）。　　[结论]：　　本文通过优化dNA提取试剂盒、色谱分离条件及质谱条件。使用甲酸水解DNA，采用HILIC结合液相色谱串联质谱首次成功建立了动物基因组羧甲基化水平的分析方法，该方法具有灵敏度高、特异性强、快速简便的特点。并用该方法成功测定了SD大鼠不同器官组织中DNA羧甲基化的水平，为研究5caC的生物学功能提供有力的分析手段，同时应用实时荧光定量PCR检测其羟化酶TET1表达水平。结果表明，SD大鼠器官5caC水平和TET1酶表达有正相关关系，这表明TET1酶能促进去甲基化中间产物5caC的生成。该结果为研究表观遗传领域提供新的科学依据。