以耶氏解脂酵母菌(Yarrowia lipolytica)MYA2613为底盘菌,表达来源于卷枝毛霉菌(Mucor circinelloides)的基因carB,carRP后能有效生产β-胡萝卜素。本研究旨在通过调控耶氏解脂酵母工程菌内β-胡萝卜素合成代谢途径,来提高β-胡萝卜素的产量,主要包括以下内容:1.为了优化基因GGS1,carB,carRP的表达强度组合,将上述3个基因、终止子与两组不同的启动子通过DNA assemble方法拼接后,得到了两个组合TEF1p-GGS1-xpr2t-GPD1p-carB-mig1t-EXP1p-carRP-lip2t和YAT1p-GGS1-xpr2tGPD1p-carB-mig1t-FBAin1p-carRP-lip2t。转入酵母后经发酵表型验证,两株菌都产β-胡萝卜素,其中前者的产量是后者的4.18倍,有着明显的优势。2.尝试在耶氏解脂酵母内过表达来源于裂殖弧菌(Schizochytriμm)的基因DD253524,该基因编码的β-胡萝卜素合酶同时具备着六氢番茄红素合酶、六氢番茄红素脱氢酶、番茄红素环化酶这三种酶的功能域。将基因DD253524和GGS1在耶氏解脂酵母野生株MYA2613中共表达后,将验证结果为阳性的转化子进行发酵表型验证,工程菌的β-胡萝卜素产量约为3~10μg/g DCW。3.考虑增加产β-胡萝卜素工程菌的乙酰辅酶A供应来提高β-胡萝卜素的产量。为此我们设想了两个方案,一个方案是乙醇补料发酵,乙醇在酵母内有着乙醇→乙醛→乙酸→乙酰辅酶A的代谢路线,可以试图补加乙醇来增加途径中的乙酰辅酶A的供应量。另一个方案是尝试过表达家鼠源的ACL基因,ACL编码ATP-依赖的柠檬酸裂解酶增加了柠檬酸的回用,使其生成乙酰辅酶A。经发酵验证,通过提高乙酰辅酶A的供应对提高β-胡萝卜素产量的影响不大。4.性别不同的耶氏解脂酵母可以发生接合,有报道表明双倍体的酵母的大小和生长速率要优于单倍体酵母。我们构建了两个质粒,一个matB敲入质粒,一个matA敲除质粒。打算通过先在pox6位点敲入性别B基因后再敲除性别A基因。结果证明野生菌之间可以接合生成稳定的双倍体,但是工程菌却难以接合成功。此外,我们将得到的工程菌株进行发酵发现,B型比A型菌株的产量明显要高。