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目的:细胞毒素相关蛋白A(cytotoxin-associated antigen A,CagA)是由幽门螺杆菌(Helicobacter pylori,H.pylori)分泌的重要毒力蛋白,在胃癌的致病中起重要作用。大量研究表明,CagA可以和宿主细胞内的多种蛋白相互作用,激活多条信号通路,对细胞的增殖、凋亡、迁移和侵袭转移等生物学行为产生影响。本课题组在前期的研究工作中证实CagA可以和胃黏膜细胞蛋白YWHAE相互作用,激活NF-κB,但是具体的激活途径尚未阐明。因此,本研究在此基础上,拟进一步研究CagA与YWHAE互作激活NF-κB的具体途径,并深入探讨其引起的细胞侵袭转移效应,旨在进一步阐明CagA的致病机制。方法:1构建腺病毒Ad-CagA首先构建重组质粒pMD19-T-CagA,继而构建重组穿梭质粒pShuttleIRES-hrGFP-CagA,进一步利用同源重组的原理,构建重组腺病毒质粒pAdCagA。转染293A细胞,进行病毒包装,获得腺病毒Ad-CagA。Ad-CagA和Ad-GFP分别以不同浓度感染AGS细胞,荧光显微镜观察荧光的表达情况,确定最适感染的MOI值,用Western blot检测CagA蛋白的表达效果。2确定CagA与YWHAE相互作用对细胞NF-κB的激活途径将Ad-GFP和Ad-CagA分别感染AGS-siNC细胞,用不同浓度的TNF-α刺激,Western blot检测NF-κB经典途径中p65和p50蛋白在胞质、胞核表达量的变化,确定TNF-α刺激的最佳浓度。定量检测NF-κB经典途径的活化,将Ad-GFP和Ad-CagA分别感染AGSsiNC和AGS-siYWHA细胞,TNF-α以最佳浓度处理后,Western blot检测p65和p50蛋白在胞质、胞核表达量的变化以及p65的磷酸化水平;免疫荧光染色检测p65核转位。3确定CagA与YWHAE相互作用引起的细胞侵袭转移效应感染腺病毒后的细胞接种至Transwell小室(检测侵袭时提前2h在小室中铺胶),结晶紫染色,镜下观察穿过PET膜的细胞数,以检测细胞的迁移和侵袭数量;用Western blot检测上皮间质转化相关基因β-catenin、Vimentin、Snail、Slug的表达。4统计学分析采用SPSS 22.0进行配对样本T检验进行数据分析。结果:1成功构建Ad-CagA重组腺病毒腺病毒最佳感染效率为Ad-CagA 50(MOI值),Ad-GFP 50(MOI值),Western blot可检测到CagA蛋白的表达。2 CagA与YWHAE相互作用激活NF-κB的经典途径0 ng/ml、1 ng/ml、10 ng/ml的TNF-α刺激细胞后,Ad-CagA感染组与AdGFP感染组相比,诱导p65核/质比分别升高1.274±0.197、2.585±1.013、1.493±0.322倍,诱导p50核/质比分别升高1.793±0.403、1.950±0.115、1.093±0.524倍,1 ng/ml组的差异均具有统计学意义(P<0.05),选择1 ng/ml的浓度用于后续实验。定量检测NF-κB经典途径的活化:结果显示,在AGS-siNC细胞中,AdCagA感染组与Ad-GFP感染组相比可诱导p65核/质比、p50核/质比升高,促进p65磷酸化的水平显著上升,显著增多p65核转位的数量(P<0.05);在AGS-siYWHAE细胞中,当YWHAE表达受到抑制,Ad-CagA感染组与AdGFP感染组相比可诱导p65核/质比、p50核/质比升高,促进p65的磷酸化,增多p65核转位的数量(P<0.05),但是其诱导p65、p50入核,p65磷酸化以及p65发生核转位的能力较在AGS-siNC细胞中的能力显著下降(P<0.05),提示CagA可以通过与YWHAE相互作用促进NF-κB经典途径的活化。3 CagA与YWHAE相互作用对细胞侵袭转移的影响Transwell结果显示,在AGS-siNC细胞中,Ad-CagA感染组细胞迁移、侵袭数量(286.3±67.03,528.3±130.4)较Ad-GFP感染组(168.3±52.34,242.3±48.81)显著增多(P<0.05);在AGS-siYWHAE细胞中,当YWHAE表达受到抑制,Ad-CagA感染组细胞迁移、侵袭数量(171.87±59.68,355.07±103.54)较Ad-GFP感染组(126.8±65.04,187.13±39.5)增多(P<0.05),但是其诱导细胞发生迁移、侵袭的能力较在AGS-siNC细胞中的能力显著下降(P<0.05),结果表明CagA可以通过和YWHAE相互作用促进细胞的迁移、侵袭。Western blot结果显示,在AGS-siNC细胞中,Ad-CagA感染组与Ad-GFP感染组相比下调上皮样标志物β-catenin的表达,促进间质样标志物Vimentin、Snail、Slug的表达(P<0.05);在AGS-siYWHAE细胞中,当YWHAE的表达受到抑制,Ad-CagA感染组与Ad-GFP感染组相比可下调上皮样标志物β-catenin的表达,促进间质样标志物Vimentin、Snail、Slug的表达(P<0.05),但是其诱导间质样标志物Vimentin、Snail、Slug上调的幅度较在AGS-siNC细胞中的幅度下降(P<0.05),提示CagA和YWHAE相互作用促进上皮间质转化。结论:1.CagA和YWHAE相互作用激活NF-κB通路的经典途径。2.CagA和YWHAE相互作用促进胃癌细胞迁移和侵袭。3.CagA和YWHAE相互作用促进胃癌细胞上皮间质转化。