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由于人口老龄化的日益加剧以及血清前列腺特异性抗原(prostate specific antigen,PSA)等筛查手段的广泛推广,前列腺癌在我国的发病率呈逐年上升的趋势,已经严重威胁到我国的男性健康。前列腺PSA的检测,术前穿刺及Gleason评分等已经显著提高了对前列腺癌的早期发现和诊断水平,但目前尚没有新的方法和指标来准确检测肿瘤进展及评估其预后。目前大量异常表达的microRNAs(miRNAs)在前列腺癌中相继被筛选出来,为前列腺癌研究提供了新的思路,并且越来越多的证据证明miRNAs在前列腺癌转移中起着关键作用,可作为潜在的预测预后分子和靶向治疗靶点。MiRNAs是一群非编码的、单链的、约有22个核苷酸的小RNA分子,在胚胎干细胞发育及上皮间质转化过程中起着重要作用。在前列腺癌中,异常表达的miRNAs与肿瘤的进展密切相关,其通过调控靶基因在肿瘤中起到抑癌基因或原癌基因的作用,部分可促进前列腺癌转移的(miR-21,miR-182,miR-221,miR-222),部分抑制前列腺癌转移的(miR-205,miR-34a)。尽管miR-132/212已证明与多种恶性肿瘤的增殖和侵袭直接相关,Formosa等发现miR-132在前列腺癌中由于启动子甲基化表达明显下调,但它们在前列腺癌中的作用机制还没有完全明确。研究目的:1、分析miR-132/212在PCa中的表达情况及功能;2、研究miR-132/212在PCa中对TGF-β诱导的EMT的作用;3、探讨miR-132/212在前列腺癌中的靶基因。创新点及意义:1、本研究揭示过表达miR-132/212在PCa中对TGF-β诱导的EMT的抑制作用;2、证明了 SOX4是miR-132/212的直接靶基因;3、本研究发现了miR-132/212是一个潜在的生物学预后标记,miR-132/212/SOX4在转移的前列腺癌中有望成为有效的治疗靶点。研究方法:1、探讨miR-132/212在PCa中的表达情况1.1采用实时定量聚合酶链反应(RT-qPCR)检测3种前列腺细胞株(Vcap,Lncap和RWPE)中miR-132和miR-212的表达情况。1.2收集57例前列腺癌和14例良性前列腺增生组织,采用RT-qPCR检测miR-132/212在前列腺癌中的表达情况及其与临床病理学参数的相关性分析。1.3运用GSE21304数据库进一步探查m i R-132/212在前列腺癌中的表达特征。2、研究miR-132/212在PCa细胞中的生物学功能2.1 MTS检测miR-132/212对Vcap和Lncap前列腺癌细胞增殖的影响。2.2 Transwell检测miR-132/212对Vcap和Lncap前列腺癌细胞侵袭能力影响。2.3细胞划痕实验检测miR-132/212对Vcap和Lncap前列腺癌细胞迁移能力影响。2.4平板克隆形成实验检测miR-132/212对Vcap和Lncap前列腺癌细胞克隆形成的能力影响。3、研究miR-132/212在前列腺癌细胞中对TGF-β诱导的EMT的作用3.1倒置显微镜下观察TGF-β以5 ngml-1诱导72h后对细胞形态的影响。3.2 Western blot检测miR-132/212对细胞中TGF-β诱导后EMT标志性指标的影响。3.3 RT-qPCR检测miR-132/212对细胞中TGF-β诱导后EMT标志性指标的影响。4、鉴定SOX4是否为miR-132/212的靶基因蛋白4.1软件预测SOX4受miR-132/212的潜在调控。4.2运用Western blotting检测SOX4在Vcap和Lncap细胞中的蛋白水平表达受miR-132/212的负性调控。4.3荧光素酶报告检测SOX4受miR-132/212的直接调控。5、分析在前列腺癌组织中SOX4与miR-132/212表达的相关性5.1运用免疫组织化学检测SOX4在前列腺癌组织中的蛋白水平表达同miR-132/212 的表达。5.2提取前列腺癌石蜡标本的RNA,运用RT-qPCR方法检测组织SOX4 mRNA水平同miR-132/212的相关性。5.3运用GSE21032数据库探索miR-132/212和SOX4表达在转录水平之间的关联性。结果:1 MiR-132/212在前列腺癌中低表达,并与前列腺癌的Gleason评分的增高及远处转移呈显著相关性1.1 57例前列腺癌组织中miR-132和miR-212的表达水平较14例良性前列腺增生组织下调,两者均有统计学意义(P<0.05)。1.2 miR-132/212的低表达与前列腺癌的Gleason评分的增高(P=0.028/P =0.004)及远处转移(P=0.043/0.001)呈显著相关性。1.3 3种前列腺细胞系中在相对良性细胞株RWPE中miR-132和miR-212的表达水平明显高于侵袭性癌细胞株Vcap和Lncap中的表达,差异具有统计学意义(P<0.05)。1.4运用GSE21304数据库分析显示miR-132在高Gleason评分的Pca中同低Gleason评分的Pca相比表达明显降低,然而miR-212的表达同Gleason评分高低没有相关性。2 MiR-132/212在体外具有抑制前列腺癌细胞迁移和浸润的作用功能上,在前列腺癌细胞株Vcap和Lncap验证得知,转染miR-132/212 mimics后会明显降低其细胞的迁移和浸润的能力及克隆形成数,miR-132/212对前列腺癌细胞的增殖没有明显的作用(P>0.05)。3 MiR-132/212在前列腺癌细胞中抑制TGF-β诱导的EMT3.1 5ng/mlTGF-β持续刺激LnCap、VCap细胞3天后,细胞均发生明显的形态改变,细胞变为长梭形,细胞彼此相对分散,向间质细胞表型转变。3.2 Vcap和Lncap细胞经TGF-β诱导24h后,再转染miR-132/212 mimics,inhibitors或NC,进行qPCR及Western blot检测,可观察到TGF-β作用后可诱导细胞发生EMT的分子学改变,即引起E-Cadherin下调,vimentin表达上调,而转染miR-132/212 mimics则可逆转TGF-β对E-Cadherin、vimentin的调节作用,相反,转染miR-132/212 inhibitors可恢复TGF-β作用后发生的分子学改变。4 SOX4是miR-132/212的直接靶基因4.1本部分首先用计算机软件TargetScan和miRanda预测发现SOX4是miR-132/212的潜在靶基因。4.2 Western blot结果显示:miR-132/212 mimics转染后,与对照组相比,SOX4蛋白表达显著降低。4.3 SOX4荧光素酶载体连同miR-132/212mimics一起转染到293T细胞中,荧光素酶检测结果显示:miR-132/212组的荧光值表达比对照组显著降低,差异具有统计学意义(P<0.05)。5 SOX4与miR-132/212的表达水平在前列腺癌组织中呈负性相关5.1将这57例前列腺癌组织分为SOX4阴性-弱阳性表达组和SOX4中等阳性-强阳性表达组,SOX4中等阳性-强阳性表达组的miR-132/212的含量显著低于SOX4阴性-弱阳性表达组(P<0.001/P =0.0024)。5.2利用Spearman等级相关分析发现SOX4在mRNA水平与miR-132(rs=0.569,P<0.001)及 miR-212(rs=0.528,P<0.001)呈负相关。5.3生物信息学数据显示SOX4异常表达同miR-132的表达呈负相关(R=-0.25,P=0.009),然而,SOX4过表达同miR-212的表达之间无相关性(R=0.05,P=0.578)。结论:我们数据表明miR-132/212在前列腺癌发生发展过程中可直接靶向SOX4调控EMT,从而起到肿瘤抑癌基因的作用。