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尿激酶型纤溶酶原激活剂受体 (urokinase receptor,uPAR)基因的表达与肿瘤的侵袭转移密切相关?我们以肺巨细胞癌高转移株 95D 和低转移株 95C 为细胞模型,在转录水平探讨了 uPAR 差异表达的原因,以期为抗肿瘤侵袭转移提供一定的理论依据? 为了探讨 uPAR 基因在转录水平的调控机制,分析该基因的转录调控与细胞侵袭转移的关系,本论文对 uPAR 基因的转录调控进行了以下的研究:1,Matrigel体外侵袭实验及 Western blot 检测证实了 uPAR 基因的表达水平与细胞的侵袭转移能力存在正相关? 2, 分别用 3 对引物从两株细胞中拷贝出 2238bp 的 uPAR启动子,测序及瞬时转染实验寻找 uPAR 启动子序列是否存在引起该基因差异表达的重要突变位点?3,以正常人 uPAR 基因启动子的荧光素酶报告基因质粒为基础,通过构建系统缺失克隆,瞬时转染细胞并测定荧光素酶报告基因活性,确定影响 uPAR 基因差异转录必需的启动子区域?4,对影响 uPAR 基因差异表达的启动子区域做连接体扫描突变,寻找关键的顺式作用元件? 5,应用甲基化特异性PCR(Methylation Specific PCR, MSP)方法结合 DNA 测序分析 uPAR 基因启动子中 CpG 甲基化的状态?6,运用电泳迁移率改变实验(Electrophoretic Mobility Shift Assay, EMSA)以及 RT-PCR 实验来检测在两株细胞中,影响 uPAR 差异表达的反式作用因子的表达情况? 在 uPAR 基因的转录调控研究过程中,我们发现: 1,uPAR 基因的表达与肿瘤的侵袭转移能力密切相关,高转移的肺巨细胞癌细胞株 95D 表达的 uPAR 的水平远高于低转移的肺巨细胞癌细胞株 95C? 2,比较 95D 细胞株及 95C 细胞株中 2238bp 的 uPAR 启动子序列(-2050～+188),共有 5 处碱基存在差异,但瞬时转染及报告基因活性测定的结果显示,这种碱基差异对启动子活性无显著影响? 3,对正常人 uPAR 基因启动子的系统缺失分析发现从转录起始点上游-136bp 到下游+9bp 是影响该基因差异表达的重要启动子区域?该区域缺少传统的 TATA box 和 CCAAT box,但富含 GC 以及多个转录因子结合位点? 4,连续扫描突变及瞬时转染/报告基因活性测定的结果揭示了位于 uPAR 启动子-136～+9 区的 2 个 Sp1 结合位点及一个 NF-κB 位点是该启动子发挥作用的必需元件? 5,尽管生物信息学分析的结果显示在转录起始点上游的-172bp 到翻译起始点这一段 DNA 序列存在一个 CpG 岛,且其中的一个 CpG 位点位于 Sp1 结合位点中,但甲基化特异性 PCR 结合测序反应结果显示,两株细胞的 uPAR 启动子的 2<WP=7>甲基化状态并无差别,提示DNA的甲基化可能没有参与uPAR基因的转录调控? 6,共转染实验显示外源性的转录因子 Sp1 和 NF-κB 能显著增强 uPAR 基因启动子的活性? 7,电泳迁移率改变实验(EMSA)及 RT-PCR 的实验结果显示,两株细胞中转录因子 Sp1 和 NF-κB 的水平存在显著差异,这可能是 uPAR 基因在转录水平差异调控的重要原因?