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肿瘤转移是大多数恶性肿瘤患者死亡的主要原因之一，但肿瘤转移的具体发生机制目前仍未完全明确。黑色素瘤是一种高度恶性、转移率高的肿瘤。黑色素瘤多发生于皮肤，大部分肿瘤在早期即可发生血行转移，肺转移是黑色素瘤最常见的血行转移部位。目前临床对于恶性黑色素瘤患者的治疗以手术联合放、化疗为主，但对于已发生转移的肿瘤患者仍然没有更好的治疗方法。肿瘤转移发生时，肿瘤细胞从原发部位病灶分离，通过降解周围组织细胞外基质而迁移并侵入血管和淋巴管，随循环到达远处脏器并在局部形成肿瘤转移灶。在肿瘤细胞转移过程中，受到体内多种因素的调节。肿瘤细胞诱导的血小板聚集（TCIPA）在肿瘤转移中起重要作用。血行转移发生时，由原发病灶进入到血液循环内的肿瘤细胞与血小板粘附聚集，激活血小板，形成血小板与肿瘤细胞聚集团块，使肿瘤细胞逃避宿主免疫系统捕获，同时活化的血小板释放各种生长因子和促血管生成因子，促进肿瘤细胞向新的转移部位迁移。平足蛋白（Podoplanin, PDPN）是一种I型唾液酸跨膜糖蛋白，由具有高度糖基化的胞外结构域，跨膜部分和短胞质尾区组成。PDPN选择性表达于淋巴内皮细胞，作为淋巴内皮细胞标志物已被广泛应用。除此之外，PDPN还具有调节血管淋巴管的发育，调节细胞运动，促进肿瘤发生和转移的多种功能。在多种肿瘤细胞上可检测到PDPN的表达，包括小鼠及人黑色素瘤细胞上也可检测到PDPN的表达。有研究表明表达于某些肿瘤细胞表面上的PDPN通过促进肿瘤细胞侵袭和扩散促进肿瘤的发生及转移，但其具体作用机制尚不清楚。C型凝集素样受体2（CLEC-2）属于II型跨膜蛋白，表达于血小板表面，是PDPN的内源性受体。CLEC-2可通过与PDPN的相互作用诱导血小板激活、聚集。之前有研究表明，PDPN与CLEC-2相互作用诱导的血小板激活，是胚胎期血管淋巴管发育的重要影响因素。近年来，对于PDPN与CLEC-2相互作用诱导的血小板活化在免疫、肿瘤及感染等方面作用的研究越来越引起人们的重视。在本研究中，我们筛选分离PDPN表达水平不同的小鼠黑色素瘤细胞，建立CLEC-2基因缺陷小鼠模型并获得CLEC-2基因缺陷血小板。建立实验性小鼠黑色素瘤肺转移动物模型，通过进行体外和体内实验研究，探讨PDPN和CLEC-2在小鼠黑素瘤血行肺转移过程中对血小板激活的作用，以及二者间的相互作用对小鼠黑色素瘤肺转移的影响。并进一步研究Syk酪氨酸激酶信号传导通路在PDPN和CLEC-2激活血小板过程中及对小鼠黑色素瘤肺转移的作用。1.流式细胞术分离小鼠黑色素瘤B16-F0PDPN+细胞及PDPN-细胞，建立骨髓移植CLEC-2基因缺陷小鼠模型。经抗PDPN抗体染色，流式细胞术筛选分离并培养B16-F0细胞，经流式细胞学及免疫印迹法检测证实PDPN+细胞及PDPN-细胞中PDPN表达情况。体外培养结果显示两种细胞体外生长增殖无差异。建立骨髓移植CLEC-2基因缺陷小鼠，并取外周血经流式细胞学检测证实小鼠体内CLEC-2基因清除率。2. PDPN与CLEC-2在体外通过激活血小板促进肿瘤细胞与血小板的聚集。在体外将B16-F0PDPN+细胞及PDPN-细胞分别与野生型血小板及CLEC-2基因缺陷血小板相混合，通过流式细胞学检测、Western blot检测、IF及ICC法比较各组血小板与肿瘤细胞聚集情况。结果显示PDPN+细胞与野生型血小板混和组血小板与肿瘤细胞聚集明显高于其他组，并在镜下观察到明显的血小板与肿瘤细胞聚集团块。3. PDPN与CLEC-2相互作用诱导体内血小板激活，通过血小板与肿瘤细胞聚集作用促进肺组织对肿瘤细胞的捕获。将以不同荧光染色剂染色的PDPN+细胞及PDPN-细胞等量混和后，经尾静脉注射给野生型小鼠建立实验性小鼠黑色素瘤肺转移模型。注射后30min，2h及6h处死小鼠并取小鼠肺组织，免疫荧光显微镜下观察到在野生型小鼠肺组织内被捕获的PDPN+肿瘤细胞数量明显高于PDPN-细胞。比较注射给野生型小鼠及CLEC-2基因缺陷小鼠30min后肺组织内肿瘤细胞被捕获情况，PDPN+在野生型小鼠肺组织内数量明显高于其他三组。将PDPN+细胞及PDPN-细胞分别注射给野生型小鼠，比较注射前后小鼠体内血小板水平的变化，注射PDPN+组小鼠体内血小板下降较PDPN-组明显。结果表明PDPN与CLEC-2相互作用诱导小鼠体内血小板激活，并引起体内血小板与肿瘤细胞的聚集。4. PDPN与CLEC-2相互作用促进小鼠黑色素瘤肺转移的发生。比较PDPN+细胞、PDPN-细胞分别注射给野生型小鼠及CLEC-2缺陷小鼠体内引起小鼠黑色素瘤肺转移发生的情况。结果显示PDPN+肿瘤细胞在野生型小鼠体内肺转移率明显高于其他组。肺组织H&E染色结果分析表明PDPN+细胞在野生型小鼠肺组织转移结节数量及转移结节面积均明显高于其他组。5. Syk信号通路在PDPN与CLEC-2介导的血小板聚集及肿瘤转移过程中起着重要作用。用Syk酪氨酸激酶抑制剂R406在体内外干预血小板与肿瘤细胞介导的血小板激活及聚集。Western blot结果显示PDPN+细胞与野生型血小板作用激活Syk磷酸化，促进血小板的聚集作用。流式细胞术及免疫荧光染色分析结果表明R406在一定程度上阻断了体外PDPN+肿瘤细胞与血小板的聚集。体内实验同样显示R406部分抑制了小鼠黑色素瘤的肺转移。6. PDPN与CLEC-2的相互作用不影响小鼠黑色素瘤皮下肿瘤的生长将PDPN+细胞及PDPN-细胞分别注射给野生型小鼠皮下，建立小鼠黑色素瘤皮下移植肿瘤模型，结果显示PDPN+肿瘤及PDPN-肿瘤体内生长无明显差异。病理组织H&E染色结果显示两种肿瘤在组织形态上无明显差异。综上，本研究利用FACS筛选PDPN表达不同的小鼠黑色素瘤细胞，并建立骨髓移植CLEC-2基因缺陷小鼠，通过肿瘤细胞与血小板体外实验研究及建立实验性小鼠黑色素瘤肺转移动物模型研究，明确了小鼠黑色素瘤细胞表达的PDPN与血小板CLEC-2相互作用，在体、内外均能够诱导血小板的活化，二者在体内诱导的血小板激活促进小鼠黑色素瘤肺转移的发生，其中血小板的活化是部分依赖于Syk酪氨酸激酶信号通路完成的。肿瘤细胞表达的PDPN及血小板CLEC-2有望成为预示黑色素瘤肿瘤转移发生及抗肿瘤转移治疗的新靶点。