H9N2亚型禽流感病毒（Avian Influenza Virus,AIV）于1966年首次在北美火鸡体内发现并分离出来,随后传播到世界各地,严重危害养禽业的生存及发展,是当前全世界流行的主要亚型之一。在我国,H9N2亚型AIV于1994年首次在广东地区分离出来。随后,该亚型病毒在我国大陆的流行范围逐渐扩大,给养禽业带来巨大的经济损失。目前,疫苗免疫仍是防控H9N2亚型AIV的主要策略,疫苗株A/chicken/Shan ghai/F/98、A/chicken/Beijing/1/94等的使用发挥了重要作用。然而随着疫苗的广泛、频繁使用,病毒在免疫压力下加速进化和抗原变异,造成近年来H9N2亚型AIV的流行愈演愈烈。本研究的目的是,在分析华东部分地区H9N2亚型AIV流行株HA基因抗原变异特征的基础上,开展对疫苗候选株的筛选。1.华东部分地区H9N2亚型禽流感病毒流行病学调查本研究对2018年12月-2019年11月某养殖公司的送检病料及流调样品共1007份,进行病毒的分离、鉴定和分析,共判定292份H9亚型AIV阳性样品,检出率约为29%。流调结果提示H9亚型AIV 阳性样品的检出率具有明显的季节差异性,其中冬春季的检出率普遍较高,夏季普遍较低。随后选取了其中61个2018年-2019年H9N2亚型AIV流行株进行HA基因测序,利用DNAStar、CLC、MEGA7.0等软件对HA基因测序结果进行拼接比对、绘制HA基因遗传进化树、对关键位点进行比对分析、揭示这些H9N2分离株的抗原变异规律。结果初步显示,本研究选取的61株分离自2018年-2019年的H9N2流行株,均属于h9.4.2.5分支。这61个流行株之间的核苷酸同源性达到了 91.0%-100.0%,氨基酸同源性在90.4%-100.0%,亲缘关系较近。分析这61个流行株的HA蛋白糖基化位点变化,发现所有流行株都具有218G-/313G+这一特征性变化,证明了我国华东部分地区H9N2亚型AIV抗原变异的趋向性和稳定性。分析这61个流行株的HA蛋白受体结合位点变化,发现在第198位和第234位氨基酸的突变最为明显,所有流行株的198V突变成198A或198T;且都具有Q234L,这一突变可以使得AIV感染哺乳动物的能力大大增加。2.H9N2疫苗株的筛选及免疫效果评估实验第二部分是针对疫苗株A/chicken/Anhui/BRI-99/2016（#99）的HA突变文库毒株和14个H9N2亚型AIV流行株的抗原性分析和交叉保护性分析。本研究从#99突变病毒文库中筛选得到两个重要的逃逸突变病毒:99TB-15和99TB-D,其分别带有207NTT糖基化突变位点和T197A氨基酸突变位点。同时,综合抗原性分析、交叉血凝抑制试验和免疫攻毒保护试验的结果,发现A/chicken/Changzhou/193/2019（CZ193）与其它分支的毒株抗原差异较小,交叉保护能力良好。在免疫攻毒保护试验当中,使用CZ193制备的灭活疫苗在免疫SPF鸡后,产生了较高、稳定、持久的抗体水平,并且完全抵抗住了#99病毒的攻击,保护率达到100%;而所筛选的逃逸突变病毒99TB-15和99TB-D免疫所产生的抗体对#99病毒不具有完全保护性,其突变意义有待进一步研究。因此,最终分析发现CZ193毒株是较为理想的H9N2亚型AIV疫苗候选株。且该实验结果与H9N2亚型AIV排毒实验相比,灭活疫苗的应用使得所感染的SPF鸡的排毒时间缩短4天左右,免疫系统的反应速度也明显加快,证明了疫苗免疫的有效性和必要性。综上所述,本研究的结果表明,近两年华东部分地区H9N2亚型AIV的流行株主要为h9.4.2.5分支的病毒。综合抗原性分析、病毒的增值效率、刺激宿主抗体水平、交叉免疫保护能力等因素,建议将A/chicken/Changzhou/193/2019（H9N2）毒株作为疫苗候选株使用。