稀有鮈鲫卵黄蛋白原基因克隆、序列分析及mRNA定量检测

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稀有鮈鲫(Gobiocypris rarus)是我国特有的一种小型鲤科鱼类,并已作为一种新型的模式实验鱼应用于鱼类遗传学、鱼病学、环境科学以及转基因观赏鱼等研究领域。卵黄蛋白原(vitellogenin,Vg)是卵生动物卵黄形成过程中大量存在于雌性动物血液中的富含糖、脂、磷的高分子量蛋白,是几乎所有卵生动物卵黄蛋白的前体。本实验根据NCBI网站上公布的稀有鮈鲫卵黄蛋白原cDNA序列设计引物,通过普通PCR技术获得6299bp序列;然后以获得的6299bp序列的5’端为模板,设计两对引物,通过基因组步移技术克隆得到1285bp的序列。经过Seqman拼接软件后得到7573bp序列,其中卵黄蛋白原基因全序列长6595bp,上游调控序列978bp。经开放性阅读框分析得到:稀有鮈鲫卵黄蛋白原基因含有26个外显子和25个内含子,编码1299个氨基酸序列,CDS长3900bp。将稀有鮈鲫卵黄蛋白原cDNA基因序列进BLAST(http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)同源性分析,结果发现:所得的序列与斑马鱼、鲮、喀拉鲃、唐鱼、锦鲤卵黄蛋白原基因cDNA序列的相似性分别为69%、88%、87%、63%、70%;经预测得到的稀有鮈鲫卵黄蛋白原氨基酸序列,与斑马鱼、鲮、喀拉鲃、唐鱼、锦鲤卵黄蛋白原氨基酸序列进行比对,相似性分别为76%、85%、91%、82%、88%。通过开放性阅读框分析,还发现,与斑马鱼相比,稀有鮈鲫卵黄蛋白原中插入了一段序列,长度为21bp,位于第1外显子和第3外显子之间,可能导致7个氨基酸序列的插入;另外,稀有鮈鲫卵黄蛋白原第22个外显子(252bp)比斑马鱼卵黄蛋白原第21个外显子(312bp)少了一段60bp的序列。将稀有鮈鲫和斑马鱼卵黄蛋白原基因序列均去除内含子,分别得到4212bp(稀有鮈鲫)和4256bp(斑马鱼)的卵黄蛋白原基因编码区,两者比较后发现相似性为69%。经BLAST比对发现,稀有鮈鲫卵黄蛋白原上游调控序列中220bp-838bp区间与朝鲜鱊(Acheilognathus yamatsutae)卵黄蛋白原基因启动子序列2857bp-3144bp区间有80%相似性。根据稀有鮈鲫卵巢的发育情况,可以将稀有鮈鲫的卵巢分为六期。本实验以稀有鮈鲫卵巢发育三个不同时期,卵黄发生前期(第I期)、卵黄发生期(第II期)、卵巢成熟后期(第III期)为研究对象,取肝脏组织提取RNA,通过荧光定量PCR技术检测稀有鮈鲫卵黄蛋白原的mRNA在三个时期内的定量表达。结果发现,在肝脏中,随着卵巢的发育,在第II期中卵黄蛋白原m RNA的表达量最高,相对表达量达到25.202,而第I期和第III期较低,仅2.4和1.0。本研究结果为丰富鱼类繁殖发育生物学,进一步探索稀有鮈鲫这一具有重要研究价值的鱼类提供科学依据。
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