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目的： 探究乳腺癌组织及细胞中miR-34和神经激肽1受体(neurokinin1receptor,NK1R)的表达,及miR-34和NK1R对乳腺癌细胞增殖和迁移侵袭能力的影响,希望为乳腺癌的防治提供新的证据. 方法： 1.临床组织标本及细胞系表达 收集2013年2月~5月天津市肿瘤医院乳腺肿瘤科50例乳腺癌组织及癌旁组织标本,临床诊断均经病理学证实,其中浸润性导管癌46例、浸润性乳头状癌2例、髓样癌2例.TNM分期采用乳腺癌AJCC指南(第七版)的病理分期标准,其中乳腺癌Ⅰ期14例、Ⅱ期21例、Ⅲ期15例.实时荧光定量PCR(realtime-polymerase chain reaction,RT-PCR)检测乳腺癌组织及癌旁组织中miR-34b/c-5p及NK1R-Tr表达,统计学方法进一步分析其与乳腺癌病理资料的相关性.采用蛋白免疫印迹和RT-PCR实验检测乳腺癌细胞中NK1R的表达,RT-PCR检测miR-34的表达. 2.miR-34对NK1R的表达调控 生物信息学软件预测到miR-34与NK1R的3UTR区存在结合位点.在乳腺癌MDA-MB-231及MCF-7细胞中分别过表达及降表达miR-34家族后检测NK1R的表达.构建神经激肽1受体-全长型(NK1R-full length,NK1R-FL)野生型质粒和NK1R-FL突变型质粒,分别与miR-34b/c-5p模拟物(mimic)及模拟物对照(mimic control)共同转染MDA-MB-231及HEK-293T细胞,检测荧光活性,探究miR-34-b/c-5p对NK1R-FL的调控作用. 3.miR-34b/c-5p及NK1R对乳腺癌细胞功能的影响 在MDA-MB-231及MCF-7细胞中分别过表达miR-34b/c-5p、使用NK1R拮抗剂和敲低NK1R后,采用CCK-8及克隆形成实验检测miR-34b/c-5p和NK1R对细胞增殖的影响.在MDA-MB-231细胞中改变miR-34b/c-5p及NK1R的表达水平后,采用划痕及Transwell小室实验检测miR-34b/c-5p和NK1R对细胞迁移侵袭的影响. 4.miR-34b/c-5p及NK1R对乳腺癌细胞周期及凋亡的影响 在MDA-MB-231及MCF-7细胞中分别过表达miR-34b/c-5p、使用NK1R拮抗剂和敲低NK1R后,采用流式细胞术及AnnexinV/PI染色实验检测miR-34b/c-5p和NK1R对细胞周期及凋亡的影响.蛋白免疫印迹实验检测miR-34b/c-5p及NK1R对细胞周期相关蛋白的调控,检测Caspase-3酶活性探究miR-34b/c-5p及NK1R调控细胞凋亡的具体机制. 5.TGF-β1、miR-34b/c-5p及NK1R间的相互表达调控 使用不同浓度的TGF-β1在不同时间点处理MDA-MB-231及MCF-7细胞,检测miR-34b/c-5p及NK1R的表达水平. 6.c-myc参与miR-34b/c-5p对神经激肽1受体-截短型(neurokinin1receptor-truncated,NK1R-Tr)的表达调控 在MDA-MB-231及MCF-7细胞中敲低c-myc后过表达miR-34b/c-5p,检测NK1R-Tr的表达,探究miR-34b/c-5p对NK1R-Tr的调控机制. 7.miR-34b/c-5p抑制乳腺癌细胞的成瘤能力 在MDA-MB-231细胞中转染miR-34b/c-5p稳定激动剂(angimor)及相应的对照序列,3天后注射于裸鼠皮下.每周两次测量肿瘤的大小.27天后统一处死小鼠,取出肿瘤,测量大小,称其重量并将数据进行统计学分析. 结果： 1.乳腺癌组织及细胞中miR-34和NK1R表达 乳腺癌组织中miR-34b/c-5p的表达水平显著低于癌旁组织(均P<0.001),而NK1R-Tr的表达水平显著高于癌旁组织(P<0.01).在50例乳腺癌组织标本中,低水平miR-34b/c-5p和高水平NK1R-Tr与乳腺癌分期和Ki-67的水平密切相关,差异有统计学意义(均P<0.05).乳腺癌组织中miR-34b-5p和miR-34c-5p的相对表达量呈正相关(r=0.762,P<0.001),miR-34b-5p和NK1R-Tr的相对表达量呈负相关,miR-34c-5p和NK1R-Tr的相对表达量呈负相关.在雌激素ER或孕激素PR阳性的乳腺癌组织中,NK1R-Tr的表达高于阴性患者(均P<0.05).HER-2阳性的乳腺癌组织中miR-34c-5p的表达量高于HER-2阴性的组织(P=0.006).乳腺癌MDA-MB-231、MCF-7及T47D细胞中miR-34和NK1R-FL的表达水平低于SK-BR-3及HBL-100细胞,而NK1R-Tr的表达水平高于SK-BR-3及HBL-100细胞. 2.miR-34b/c-5p负向调控NK1R 在MDA-MB-231和MCF-7细胞中过表达miR-34b/c-5p后,NK1R-Tr和NK1R-FL的表达水平均下降(均P<0.05);降表达miR-34b/c-5p后,NK1R-Tr和NK1R-FL的表达水平均上升(均P<0.05).而改变miR-34a和miR-34b/c-3p的表达水平,NK1R-Tr和NK1R-FL表达变化不明显(均P>0.05).在MDA-MB-231及HEK-293T细胞中,共同转染miR-34b/c-5p mimic和NK1R-FL野生型质粒与共同转染miR-34b/c-5p mimic和NK1R-FL-突变型质粒进行比较,荧光活性明显降低(均P<0.05),而共同转染miR-34b/c-5p mimic和NK1R-FL-野生型质粒及miR-34b/c-5p mimic和NK1R-FL-突变型质粒进行比较,荧光活性无明显变化(均P>0.05). 3.miR-34b/c-5p及NK1R对乳腺癌细胞功能影响 在MDA-MB-231及MCF-7细胞中过表达miR-34b/c-5p及敲低NK1R可以抑制乳腺癌细胞的增殖、迁移侵袭,并诱导凋亡,调控细胞周期相关蛋白表达,诱导细胞阻滞在G2/M期.与单独转染miR-34b/c-5p mimic进行比较,miR-34b/c-5p联合NK1R拮抗剂剂阿瑞匹坦(aprepitant)可明显抑制细胞增殖及凋亡能力(均P<0.05). 4.c-myc参与miR-34b/c-5p对NK1R-Tr的表达调控 在MDA-MB-231及MCF-7细胞中敲低c-myc并过表达miR-34b/c-5p后,与对照组相比,NK1R-Tr的表达量无明显变化. 5.TGF-β1下调miR-34b/c-5p,而上调NK1R-Tr的表达. 6.miR-34b/c-5p抑制乳腺癌细胞在裸鼠体内的成瘤能力 转染miR-34b/c-5p angimor的裸鼠组与对照组进行比较,肿瘤的体积明显降低(均P>0.05),重量也明显降低(均P>0.05). 结论： 在乳腺癌组织中,miR-34b/c-5p和NK1R-Tr的表达与乳腺癌进展密切相关,miR-34b/c-5p与NK1R-Tr的表达呈负相关.乳腺癌细胞中miR-34b/c-5p负向调控NK1R的表达.miR-34b/c-5p可结合于NK1R-FL的3UTR区,而对NK1R-Tr的调控需要c-myc参与.miR-34b/c-5p可逆转TGF-β1对NK1R-Tr的表达调控作用.miR-34b/c-5p主要通过作用于NK1R-Tr抑制乳腺癌细胞的增殖、迁移及侵袭,诱导细胞阻滞在G2/M期,并诱导细胞凋亡.miR-34b/c-5p及NK1R可能成为乳腺癌新的治疗靶点.