研究背景肺动脉高压(pulmonary arterial hypertension,PAH)是肺高血压的一种类型,关于PAH的发病机制尚未完全明确,其病理基础是肺血管重构,导致肺动脉阻力进行性增加,引起右心室负荷增加及右心衰竭,随着研究的深入和增加,发现许多因素参与了肺动脉高压的发生发展以及预后,包括细胞凋亡、免疫因素及炎症机制等,其中炎症反应是近几年研究的热点。Tuder等首次在PAH病人的丛状病损动脉壁周围检测出T淋巴细胞、B淋巴细胞和巨噬细胞等炎症细胞浸润,由此开启了人们对PAH与炎症反应相关性研究。随后Humbert 等发现,在确诊的特发性肺动脉高压(idiopathic pulmonary arterial hypertension,IPAH)病人,血清抗核抗体、炎性因子白细胞介素1(Interleukine-1,IL-1)和白细胞介素6(Interleukine-l,IL-6)的水平升高,而IL-1受体拮抗剂可减轻野百合碱(Monocrotaline,MCT)诱导的PAH大鼠的症状。另有研究表明高迁移率族蛋白1(High-mobility group proteinB1,HMGB1)是一种强致炎因子,PAH病人血清HMGB1显著升高,抑制HMGB1可降低肺动脉压,提示了炎症因子与PAH的相关性。基于PAH的发生机制,通过抑制血管重构和促血管再生治疗肺动脉高压是研究的主要方向,HGF作为一种具有明显促血管再生作用的细胞因子而倍受青睐。在肢体缺血和心肌梗塞的动物模型上,应用基因转染等分子生物学技术证实了 HGF具有可靠的促血管再生作用,能够明显改善缺血和坏死组织的血供,从而改善其功能。有研究表明,用HGF基因转染的方法干预MCT诱导PAH大鼠,结果示HGF可降低PAH大鼠的肺血管阻力(pulmonary vascular resistance,PVR)及肺动脉平均压(mean pulmonary arterial pressure,mPAP),改善PAH血流动力学及右心功能。Coudriet等研究了 HGF对于骨髓源性巨噬细胞的炎症调节作用,结果显示HGF可降低致炎因子IL-6水平,升高抗炎因子IL-10水平,促使糖原合成酶激酶3β(glycogen synthase kinase3-β,GSK3β)磷酸化增加,导致其失活,而GSK3β是炎症发生的重要调节酶,可增加炎症因子释放,IL-6则是肺动脉高压发生的重要炎症因子之一。给予炎症因子抑制剂(白介素抑制剂或HMGB1抑制剂)干预PAH大鼠模型,可降低血清炎症因子水平,降低mPAP和右室肥厚,均提示了抗炎干预肺动脉高压的可行性。热休克蛋白(heat shock protein,HSP)是机体热应激状态下产生的一种具有自身保护作用的应激蛋白,可通过抗氧化、抗炎,调节其它蛋白质合成等作用发生,肺脏是产生HSP的主要器官之一,而HSP70是HSP家族起主要保护作用的蛋白,研究证实,HSP70在急性肺损伤或缺氧性肺动脉高压的肺动脉平滑肌细胞高表达,其效应是抑制多种炎症因子IL-1β、IL-1、IL-6、ICAM-1和TNF-α等的表达量,也可以减少氧自由基的产生,起到保护机体的作用,有研究表明HSP70的抗炎机制与下调核因子-κB(NF-κB)的表达有关,NF-κB参与了粘附分子和趋化因子在内的众多细胞因子的转录调控,是重要的炎症反应相关的信号通路,在正常情况下,NF-κB与抑制蛋白IκBα结合成三聚体稳定存在于胞浆内,当外界因素导致IκBα失活或蛋白量降低,NF-κB从胞浆转移到细胞核,激活多种信号通路而发挥生物学效应,有研究表明HSP70可使降低IκBα磷酸化减少失活,从而提高IκBα蛋白水平,进而下调NF-κB表达而降低炎症反应。既往研究结果提示HGF可通过增加HSP70的表达而起到对肝细胞凋亡(TNF-α诱导)的保护作用,而HSP70是否参与HGF干预PAH的作用尚未见文献报道。本课题观察HGF抗炎作用对PAH的影响,以及HSP70/NF-κB通路在HGF抗炎干预PAH中的作用机制。研究目的1.HGF抗炎干预对PAH大鼠血流动力学及右心功能的影响。2.HGF抗炎干预PAH大鼠的作用机制及信号通路。研究方法1.实验动物与分组选择雄性Wistar大鼠40只,随机分为5组(n=8),包括1)对照组:皮下注射生理盐水1次(1mg/kg);2)PAH组:采用腹腔注射野百合碱(60mg/kg)复制PAH模型;3)HGF组:在肺动脉高压模型建立成功(2周)后给与尾静脉注射HGF(1mg/kg);4)HGF-D组(HGF-Double):在肺动脉高压模型建立成功(2周)后给与尾静脉注射HGF翻倍剂量(2mg/kg);5)HGF+Q组(HGF+quercetin):在肺动脉高压模型建立成功(2周)后,HGF(1mg/kg)干预前6小时给与槲皮素(5mg/100g)腹腔注射抑制HSP70。2.观察各组大鼠的一般情况变化,如体重,呼吸急促,进食及死亡情况等。3.心导管检查测量各组大鼠mPAP和PVR各组大鼠观察至4周,麻醉后行气管插管,动物呼吸机维持呼吸,连接压力换能器,将三通管与3Frliller右心导管相连,右心导管内充满生理盐水,将连接压力换能器的的右心导管放至肺动脉。多导生理记录仪记录下稳定的右心室、肺动脉压力波形。4.检测各组大鼠右室心肌肥厚指数开胸取出心脏,浸入冰盐水漂洗,去除左、右心房及大血管根部,沿室间隔用剪刀将右心室游离壁剪下来,滤纸吸去表面水分,用电子天平称量右心室游离壁(RV)及左心室+室间隔(LV+S)的重量,计算右心室肥厚指数[RVHI=RV/(LV十S)]。5.超声心动图测量右心功能各组大鼠观察至4周时行超声心动图测量右心功能。探头置于胸骨左侧,与胸骨中线呈10-30°角,心尖四腔切面和右心室侧壁三尖瓣环长轴方向分别测三尖瓣环收缩期位移幅度(TAPSE)、三尖瓣环等容收缩期峰值运动速度(IVCv)、右心室面积变化分数(RVFAC)、右心室与左心室横径等指标,观察右心室功能变化。6.病理学检查及肺血管周围炎症评分麻醉大鼠后取肺脏。剪取4mm大小的块状肺脏标本,固定24小时后制成蜡块,切片染色。每张HE染色肺组织病理切片选择肺小动脉30个,按肺血管周围及肺间质炎症细胞浸润程度记为0分-4分。7.大鼠血清炎症因子IL-6、TNF-α、ICAM-1及HMGB1水平麻醉大鼠后仰卧固定在手术架上,打开腹腔,清楚暴露腹主动脉后抽血2ml左右,离心后-20℃冷存,待采集各组完毕后行ELISA检测血清炎症因子水平。8.免疫组化法测肺组织HSP70蛋白表达9.RT-PCR法检测肺组织HMGB1mRNA和HSP70mRNA水平10.Western blot法检测肺组织IκBα蛋白和NF-κBp65蛋白表达11.统计学分析统计软件采用SPSS15.0。计量资料进行正态检验,符合正态分布的采用均数±标准差表示,两组间比较采用t检验,多组间比较采用单因素方差分析SNK检验,样本量不一致时用Waller-Duncan法进行多组间比较。非正态分布资料比较采用Mann-WhitneyTest。对计数资料采用χ2检验。P<0.05具有统计学差异。研究结果1.HGF对肺动脉高压大鼠一般情况影响PAH组大鼠在注射MCT后第2周时开始出现活动减慢,皮毛不光顺,体重下降,并随时间延长而逐渐加重,部分大鼠出现口鼻紫绀,甚至有明显呼吸急促,观察至4周时死亡2只,死亡大鼠尸检显示肺组织表面有点片状出血,腹腔积液。HGF组上述表现明显减轻,口鼻紫绀表现轻微,观察至4周时没有发生死亡,体重较PAH组增加。HGF+Q组PAH大鼠症状较HGF组加重,但较PAH组仍有改善,观察至4周时死亡1只。HGF-D组与HGF组大鼠比较体重变化不明显,无大鼠死亡。2.HGF对mPAP及PVR的影响HGF组mPAP和PVR水平较PAH组明显降低(P<0.05),仍高于对照组;HGF-D组mPAP及PVR与HGF组比较差异无统计学意义(P>0.05);HGF+Q组mPAP及PVR水平均高于HGF组(P<0.05),但仍低于PAH组。3.HGF对各组RVHI水平影响HGF组大鼠右室肥厚较PAH组减轻,RVHI水平低于PAH组(P<0.05),但仍高于对照组;HGF-D组大鼠RVHI水平与HGF组比较无明显差异(P>0.05);HGF+Q组大鼠RVHI水平明显高于HGF组(P<0.05),仍低于PAH组。4.HGF对肺动脉高压大鼠右心功能影响HGF组及HGF-D组TAPSE、IVCv及RVFAC均高于PAH组(P均<0.05),仍低于对照组,RVETD/LVETD水平低于PAH组,高于对照组(P<0.05);HGF+Quercetin组TAPSE、IVCv 及 RVFAC 水平较 HGF组均降低(P 均<0.05),仍高于 PAH 组,RVETD/LVETD水平高于HGF组,低于PAH组,提示HGF+Q组较PAH组大鼠右心功能仍有改善。5.肺血管周围炎症比较5.1肺组织HE染色光镜观察PAH组大鼠肺组织血管平滑肌增生肥厚,肺小动脉管壁增厚、狭窄,甚至闭塞,肺血管周围及肺泡腔内炎细胞浸润增多;HGF组肺小动脉壁增厚不明显或轻微增生,炎细胞浸润减少;HGF-D组病理变化与HGF组比较没有进一步改善;HGF+Q组肺泡结构破坏,炎细胞浸润及肺小动脉增厚较HGF组明显加重,与PAH组略有减轻。对照组大鼠肺血管和肺泡结构正常,血管周围或肺泡腔内无明显炎症细胞浸润。5.2肺血管周围炎症PAH组大鼠肺血管周围炎症细胞浸润明显;HGF组肺血管周围炎症减轻,炎细胞浸润减少,炎症评分低于PAH组(P<0.05);HGF-D组与HGF组比较炎症评分无显著性差异;HGF+Q组炎症肺血管周围炎症较HGF组加重,但与PAH组大鼠肺血管炎症比较仍有改善。6.血清IL-6、TNF-α、ICAM-1及HMGB1水平比较HGF 组 IL-6、TNF-α、ICAM-1 及 HMGB1 水平明显低于 PAH 组(P 均<0.05),但仍高于对照组;HGF-D组与HGF比较各指标无明显差异(P>0.05)。7.HGF对肺组织HMGB1mRNA水平影响HGF组大鼠肺组织HMGB1mRNA水平低于PAH组,仍高于对照组,差异有显著统计学意义(P<0.05);HGF+Q组(加入HSP70抑制剂)大鼠肺组织HMGB1mRNA水平高于 HGF 组(P<0.05),仍低于 PAH 组(P<0.05)。8.肺组织HSP70蛋白表达水平免疫组化检查示HSP70在HGF组大鼠肺组织表达明显,主要为胞浆染色,多表达在支气管上皮、肺泡及血管内膜上皮细胞,呈棕褐色或棕黄色,为强阳性表达;PAH组大鼠肺组织HSP70表达较HGF组减弱,为棕黄色或淡黄色;对照组及HGF+Q组肺组织HSP70为阴性表达,胞浆未着色或淡黄色。在HGF组大鼠肺组织HSP70阳性表达率和强阳性表达率显著高于PAH组;PAH组大鼠肺组织HSP70阳性表达率高于对照组和HGF+Q组。9.RT-PCR 测各组 HSP70mRNA 水平HGF组大鼠肺组织HSP70mRNA相对表达量显著高于PAH组及对照组(P<0.05);PAH组大鼠肺组织HSP70mRNA相对表达量显著高于HGF+Q组(P<0.05);HSP70抑制剂组(HGF+Q)大鼠肺组织HSP70mRNA相对表达量与对照组比较差异无统计学意义(P>0.05),提示槲皮素充分抑制了 HSP70mRNA的表达。10.Western blot测肺组织IκBα蛋白表达HGF组大鼠肺组织IκBα蛋白表达水平显著高于对照组及PAH组(P<0.05);PAH组大鼠肺组织IκBα蛋白水平低于对照组(P<0.05);HGF+Q组大鼠肺组织IκBα蛋白水平低于HGF组(P<0.05),仍高于PAH组,与对照组比较差异无统计学意义(P>0.05)。11.肺组织NF-κBp65蛋白表达比较HGF组大鼠肺组织NF-κBp65蛋白水平低于PAH组及HGF+Q组(P<0.05),仍高于对照组肺组织NF-κBp65蛋白量(P<0.05);HGF+Q组大鼠肺组织NF-κBp65蛋白水平仍低于 PAH 组(P<0.05)。结论1 HGF通过抗炎和降低炎症因子水平减轻肺动脉高压大鼠肺组织炎症反应,降低肺动脉平均压,肺血管阻力及右心肥厚指数,提高PAH大鼠右心功能,改善PAH大鼠症状。2 HGF减轻炎症反应和降低炎症因子水平与诱发HSP70高表达而抑制NF-κB信号通路有关,提示HSP70/NF-KB通路是HGF抗炎降低肺动脉高压的重要通路之一。研究背景肺高血压(pulmonary hypertension,PH)是以肺血管阻力进行性增加为特征的临床疾病,常引起右心衰竭,病程进展较快,致死率高,预后差。欧洲心脏病学会(European Society of Cardiology,ESC)于2015年8月29日联合发表了新版“肺高血压诊断和治疗指南”,肺高血压是一种血流动力学和病理生理学状态,其定义为海平面条件下,静息状态下右心导管测定的平均肺动脉压(mean pulmonary arterial pressure,mPAP)≥25 mmHg。早期诊断肺高血压是比较困难的,因为肺高血压常见的呼吸困难,胸闷,乏力及胸痛等临床症状在其它心血管疾病也同样多见,右心导管作为PH诊断的金标准已达成共识,但仍然是有创检查,不易作为筛查PH的常规检查。超声心动图作为无创检查应用广泛,易被医生或患者接受,并且在2015年ESC新版PH诊治指南中更新推荐为一线无创检查方法,通过三尖瓣返流压差测定的肺动脉收缩压与实际的mPAP可能有偏差,而联合生物标记物提高预测价值是研究的热点和方向,简便易行其预测价值高的指标可以早期提示PH,通过早发现和早干预可以显著降低PH的死亡率,改善其预后。肝细胞生长因子(Hepatocyte Growth Factor,HGF)是来源于间充质的多功能细胞因子,主要表现为丝裂原,能动原和形态发生原效应,在体内分布广泛,HGF及其mRNA在小肠、脑、胸腺、支气管和肺泡上皮细胞、合体滋养层细胞及血管平滑肌细胞等均被发现,正常人血浆中即可测出循环HGF。有研究表明HGF水平在急性肺损伤或肺栓塞的早期即可升高,尤其是在肺栓塞中表现了随发病时间而变化的曲线,提示了血清HGF水平与肺栓塞存在相关性。而肺高血压患者血清HGF的水平尚未见报到,本课题观察了不同程度肺高血压患者的血清HGF水平,以及HGF与mPAP、肺血管阻力(pulmonary vascular resistance,PVR)、N 末端 B 型利钠肽原(N-terminal B-type natriuretic peptide,NT-proBNP)以及C反应蛋白(C-reactionprotein,CRP)等指标的相关性,探讨肺高血压患者血清HGF水平及意义。研究目的1.肺高血压患者血清HGF水平及意义。2.血清HGF与肺高血压患者mPAP,PVR和心脏功能的相关性。研究方法入选正常健康人群组25例,肺高血压(PH)病人组73例,PH入选标准采用2013年NICE世界肺高血压论坛发布的《肺高血压诊断和治疗建议》,肺高血压患者按肺动脉平均压水平分为3组,25mmHg≦mPAP≦30mmHg为轻度肺高血压组(L组),30mmHg<mPAP<50mmHg为中度肺高血压(M组),mPAP≧50mmHg为重度肺高血压(H组)。另根据或者是否存在继发性因素,将肺高血压组病人分为特发性肺动脉高压(IPAH)组及继发性肺高血压(PPH)组进行比较。所有患者均签署知情同意书。排除标准:1.肝脏或肿瘤疾病引起的PH;2.合并肝炎疾病的患者;3.门脉高压相关的PH;4.慢性肾功能不全引起的PH;5.无法配合完成右心导管检查的病人。收集患者临床一般资料,包括年龄、性别,肥胖,高血压史,糖尿病史,吸烟史等。PH组患者行右心导管检查,测定mPAP、PVR及心脏指数(Cardiac Index,CI)等指标,入院后次日清晨采集患者上肢静脉血,离心后收集血清,-80℃保存,ELISA法检测HGF水平,测定样品的O.D值,绘制吸光值-浓度曲线,根据曲线得出相关浓度值,自动生化分析仪测NT-proBNP、CRP及ALT水平,对照组入选人群抽血后处理同上。统计分析对于计量资料进行正态性检验,符合正态分布的资料用均数±标准差表示,非正态分布资料采用中位数(P25,P75)表示。两组间比较采用t检验,多组间比较应用SNK检验,非正态分布资料比较采用Mann-WhitneyTest,直线相关分析两个指标间的相关性,多元逐步回归分析肺动脉压与HGF相关性,对计数资料采用χ2检验。采用SPSS15.0统计软件进行分析,P<0.05具有统计学差异。研究结果1入选者一般情况各组间人群年龄、性别、肥胖比率无统计学意义;三组肺高血压患者的高血压比例、糖尿病人数及吸烟数比较无差异;PH病人接受药物治疗包括前列腺素、内皮素拮抗剂、5型磷酸二酯酶抑制剂、利尿剂及联合用药(大于等于两种治疗药物),随着肺动脉压力增加接受治疗人数比例增加。2肺动脉压相关指标H组和M组血清PVR值均明显高于L组(P均<0.05),M组与L组比较同样有统计学意义(P<0.05);CI水平则随着mPAP的升高而降低,H组和M组CI值低于L组,H组较M组明显减低(P<0.05)。3各组血清HGF水平比较肺高血压患者血清HGF水平(2.220±1.670ng/ml)显著高于正常人群(P<0.05);L组HGF水平也显著高于对照组(P<0.05);M组与L组比较差异有统计学意义(P<0.05);H组HGF水平明显高于M组和L组(P均<0.05)。继发性肺高血压组(50例)(2.649± 1.875 ng/mL)与特发性肺动脉高压组(23例)(1.632± 1.192ng/mL)HGF水平比较差异有统计学意义。4NT-proBNP、CRP 及 ALT 比较PH组血清NT-proBNP及CRP水平明显高于对照组(P均<0.05),且在PH三组间比较差异有统计学意义;H组血清NT-proBNP及CRP水平明显高于M组和L组(P均<0.05),M组NT-proBNP及CRP水平高于L组(P均<0.05);PPH组NT-proBNP及CRP水平高于 IPAH 组(P<0.05)。5相关性分析5.1 HGF与各指标相关性PH 患者血清 HGF 水平与 mPAP、PVR、NT-proBNP、CRP 呈正相关(r=0.835,0.769,0.523,0.804,P均<0.05);与 CI 呈负相关(r=-0.701,P<0.05)。在IPAH患者组,血清HGF水平与mPAP、PVR、NT-proBNP、CRP呈正相关(r=0.877,0.792,0.352,0.761,P 均<0.05);与 CI 呈负相关(r=-0.765,P<0.05)。PPH组病人血清血清HGF水平与mPAP、PVR、NT-proBNP、CRP呈正相关(r=0.735,0.711,0.652,0.821,P 均<0.05);与 CI 呈负相关(r=-0.614,P<0.05)。5.2 NT-proBNP及CRP与各指标相关性PH 组血清 NT-proBNP 水平与 mPAP、PVR、CRP 呈正相关(r=0.612,0.58,0.598,P 均<0.05);与 CI 呈负相关(r=-0.488,P<0.05)。IPAH 组病人血清 NT-proBNP 水平与 mPAP、PVR、CRP 呈正相关(r=0.525,0.439,0.468,P 均<0.05);与 CI 呈负相关(r=-0.427,P<0.05)。PPH 组病人 NT-proBNP 水平与 mPAP、PVR、CRP 呈正相关(r=0.852,0.720,0.755,P 均<0.05);与 CI 呈负相关(r=-0.631,P<0.05)。PH 组血清 CRP 与 mPAP 和 PVR 呈正相关(r=0.856,0.831,P 均<0.05);与 CI 呈负相关(r=-0.641,P<0.05)。IPAH 组病人 CRP 与 mPAP 和 PVR 呈正相关(r=0.748,0.722,P 均<0.05);与 CI呈负相关(r=-0.535,P<0.05)。PPH 组病人 CRP 与 mPAP 和 PVR 呈正相关(r=0.834,0.802,P 均<0.05):与 CI 呈负相关(r=-0.776,P<0.05)。6.ROC曲线预测(1)NT-proBNP:曲线下面积0.819,切点位置敏感性0.531,特异性0.757。(2)CRP:曲线下面积0.745,切点位置敏感性0.678,特异性0.586。(3)HGF:曲线下面积0.777,切点位置敏感性0.690,特异性0.495。(4)联合NT-proBNP、CRP及HGF:曲线下面积0.893,切点位置敏感性0.832,特异性0.783。7多元逐步回归分析多元逐步回归分析 mPAP(Y)与 HGF(X1)、NT-proBNP(X2)、CI(X3)、PVR(X4)及CRP(X5)的相关性,结果示R=0.935,R2=0.874。其中PVR和HGF均与mPAP相关(P<0.05),提示了 HGF与肺动脉平均压的相关性。结论1.肺高血压患者血清HGF水平明显升高,且和mPAP有相关性,说明HGF与肺高血压有一定的关系。2.肺高血压患者血清CRP水平明显升高,和mPAP和PVR呈正相关,提示炎症因素与肺高血压有相关性。3.NT-proBNP、CRP及HGF均与肺高血压存在相关性,联合HGF可增加对于肺高血压的预测价值。