恶性肿瘤是严重危害人类健康的疾病之一，近年来随着生活水平的提高，社会老龄化的发展，恶性肿瘤的发病率和死亡率都呈明显升高趋势。转移和复发是肿瘤治疗失败的最主要原因。肿瘤转移是恶性肿瘤最重要的特征之一，也是一个多阶段的、序贯连续的复杂过程，大致分为几个阶段：1，肿瘤细胞脱离原发瘤；2，肿瘤细胞穿过基底膜，发生组织浸润，并进入血管或淋巴管；3，在血管或淋巴管中转运、黏附和侵入靶组织；4，在靶组织生长、血管增生、形成转移灶。细胞外基质ECM包括基底膜和间隙间质，主要是由胶原，糖蛋白和蛋白多糖等一些物质组成，具有维持细胞组织形态的作用，是细胞间相互作用的重要场所。在肿瘤细胞的浸润和转移过程中，肿瘤细胞必须首先要通过ECM的降解，才能发生肿瘤细胞的浸润和迁移，并转移到他处。因此，肿瘤浸润和转移与ECM的降解有极其重要关系。ECM的降解与多种蛋白酶有关，其中包括丝氨酸蛋白酶家族中的纤维蛋白溶酶原和纤维蛋白溶酶系统，金属蛋白酶系统中的MMP-2和MMP-9，组织蛋白酶B，组织蛋白酶D，以及其他一些蛋白水解酶如透明质酸酶，胶原酶等。 SNC19(ST14)基因是我所应用减数杂交技术筛选出的大肠癌新相关基因之一。1995年被Genbank作为新基因录入，并给予登录检索号HSU20418。1998年国际基因命名委员会命名SNC19为ST14(suppression of tumorigenicity14)基因。在人类基因组计划的基因组资料11号染色体的基因图谱中已将SNC19／ST14基因收录。SNC19基因的基因组DNA全长为50420bp，共有19个外显子及18个内含子，荧光原位杂交结果显示，该基因定位于11q24-25区。SNC19／ST14基因cDNA全长为3142bp，ORF编码855个氨基酸，编码蛋白序列内含胰蛋白酶样功能区。 在国外的一些实验室先后通过不同途径发现了与SNC19基因序列一致的蛋 浙江大学博士学位论文 白，并各自命名。美国的Lin．C．Y等在人的一种乳腺癌细胞系的培养液中分离 到一种新的丝氨酸蛋白酶，经氨基酸序列分析，Genbank基因序列比对，证实 与SNC19基因相同。1999年，Lin．C．Y等发现这种丝氨酸蛋白酶具有降解细胞 外基质的作用，将其称为striptase。美国的Takeuchi等在人前列腺癌细胞 中发现并命名为。embrane－type serine protease 山T七PI）。在他们的研究 中发现，Matriptase具有降解细胞外基质的作用，并能激活uPA前体及HGF／SF吕 Bu w。 肝细胞生长因子激动子抑制因子 HAI－l（hepatocyte growth factor activator inhibitor），1997年首先在胃癌细胞系MKN45中发现，为一类新的 KnitZ型丝氨酸蛋白酶抑制因子，可特异性地抑制eFA，做活HGF前体，在肿 瘤的形成、肿瘤细胞的浸润和转移、分化及肿瘤血管形成过程中可能有重要调 节作用。其与etriptase在生理条件下在人乳中以复合蛋白的形式存在，并能 抑制Matriptase降解细胞外基质ECM功能。 为进一步研究SNC19（ST14）蛋白的生物特性，以及其在肿瘤转移中的可能作 用，本实验在核酸水平的研究基础上设计：l，将SMi19（ST14）基因克隆到原核 表达质粒，表达纯化SNC19（ST14）XIST融合蛋白；2，用SNC19（ST14）AIST融合 蛋白免疫小鼠，按杂交瘤技术制备SNC19（ST14）蛋白单克隆抗体；3，利用生物 信息学方法进行SNC19（ST14）蛋白的结构预测和功能分析；4，在IllltNA水平用 RT－PCR的方法研究在正常大肠动膜及相应肿瘤组织中表达；在蛋白水平应用免 疫组织化学方法研究正常消化道与相应肿瘤组织表达分布情况，并研究在其他／肿瘤中表达的情况，同时研究SNC19蛋白与其相关蛋白HAId蛋白在组织表达 中的关系：5，用oIM：）NA序列分析的方法比较正常 私膜及相应肿瘤组织 中SNC19（ST14）基因组DNA外显子序列的差异分析SNC19（ST14）基因突变情况。 1．SNC19原校表 粒的构建及陛会蛋白的表达： 将部分SNC19基因。DNA ORF经PCR扩憎和亚克隆，与GST融合蛋白原核表 达载体…EX4Th重组构建 SNC19皿UNEX4Th表达质粒。将 SNC19 ORF／ 2 浙江大学博士学位论文 pGEX4TZ表达质粒转化E．colt P2392细菌，以IPTG诱导表达SNC19dsT融合 蛋白。PCR扩憎SNC19基因CDNA的部分ORF结果为900hP，经DNA测序证实。 Ballllll和 Not酶双酶切证实SNC19 ORF正确克隆在NEX4TZ多克隆位点。 SDS－PAGE凝胶电泳证实11诱导表达SNC19XIST融合蛋白，大小为58kda。