卵黄高磷蛋白是鸡蛋蛋黄中主要的磷蛋白,独特的氨基酸组成和高度磷酸化使其具有很多优良的物化和生物学特性,生物信息学分析推测卵黄高磷蛋白可能具有调控生物矿化的功能。本课题首先分离制备高纯度的卵黄高磷蛋白,对其结构进行表征,鉴定磷酸化位点并结合生物信息学分析,挖掘其潜在功能,最后研究卵黄高磷蛋白调控矿化的机制和活性位点。本课题为卵黄高磷蛋白在仿生矿化中的应用奠定基础。主要研究内容和结果如下：(1)建立一种条件温和、高效简单的分离卵黄高磷蛋白的新方法,将鸡蛋蛋黄依次经等质量蒸馏水和0.17mol/LNaCl稀释离心除去蛋黄浆质,获得蛋黄颗粒,用10%1.74mol/LNaCl溶解后,添加3%w/w PEG6000并调整溶液pH至4.0,离心后透析冻干,制备的卵黄高磷蛋白(Pvti)电泳鉴定纯度为99%,得率为47%。采用该方法分别从海兰褐和白莱航鸡蛋中分离制备卵黄高磷蛋白,HPLC测定纯度分别达93.14%和91.80%,得率分别为63.93%和58.89%。进一步分析表明,这两个品种中的卵黄高磷蛋白的含量、组成成分和二级构象均无明显差异,且与Sigma的一致。此外,使用离子交换层析法制备不含多价金属离子的卵黄高磷蛋白,最佳条件为：Pvti经Na2EDTA处理后,采用梯度增加NaCl浓度(0、0.35、0.5mol/L)的Tris-HCl缓冲液(0.05mol/L, pH7.5)在DEAE柱中洗脱,收集洗脱峰经透析冻干,得到纯化的不含多价金属离子的卵黄高磷蛋白(PVtf)。(2)开展卵黄高磷蛋白结构的系统分析,研究显示卵黄高磷蛋白的氨基酸组成含有高达30%的丝氨酸(Ser),富含酸性氨基酸(Asp. Glu)和碱性氨基酸(Arg、His),含有极少量的芳香族氨基酸(Tyr、Cys、 Trp)。使用红外光谱(FTIR)和圆二色谱(CD)分析卵黄高磷蛋白二级结构主要为无规卷曲和p-折叠结构,不含金属离子的卵黄高磷蛋白p-转角结构增多。LC-ESI-MS/MS (LTQ)生物质谱技术结合生物信息学预测分析表明卵黄高磷蛋白含有87个磷酸化位点(83个P-Ser和4个P-Thr)。利用生物信息学分析9个物种来源的11种卵黄高磷蛋白以及来源于人的5种磷酸化蛋白质,进行氨基酸组成、多序列比对和进化树分析,显示均具有高丝氨酸含量,且富含酸性氨基酸的特点。鸡卵黄高磷蛋白与牙本质磷蛋白(DPP)的结构及特性相似,进化关系较近,意味着卵黄高磷蛋白可能具有与牙本质磷蛋白相似的生物功能,即在生物矿化过程中发挥重要的调控作用。(3)利用钙离子浓度计(ISE)、等温滴定量热仪(ITC)、CD和荧光光谱方法,分别从化学、热力学以及结构信息方面,较为全面地研究了卵黄高磷蛋白与钙离子的相互作用。在中性和弱碱性条件下,卵黄高磷蛋白与钙离子相互作用存在高亲和性和低亲和性两类结合位点。高亲和性位点结合常数约为104mol-1,每摩尔卵黄高磷蛋白约结合30摩尔的钙离子,该结合为焓驱动反应,卵黄高磷蛋白的构象变化为无序和p-转角结构增加,而p-折叠结构减少,主要作用力为静电、氢键或范德华力；而低亲和性位点结合常数和结合位点数并不恒定,有大量的钙离子累积在饱和钙的分子或聚集区域的附近,该结合为熵驱动反应,卵黄高磷蛋白的p-折叠结构增加,主要作用力为疏水作用力；而在酸性条件下,卵黄高磷蛋白与钙离子相互作用为熵驱动的吸热反应,主要作用力为弱的疏水相互作用。(4)研究仿生矿化体系中卵黄高磷蛋白对磷酸钙矿物晶相转化的影响。FTIR、X射线衍射(XRD)、扫描电镜(SEM)和能谱分析(EDS)表征矿物的结构、组成以及表面微观形貌,结果表明在该体系中生成的磷酸钙矿物通过“溶解再结晶”途径从磷酸氢钙(DCPD)转变为羟基磷灰石(HAP)。卵黄高磷蛋白可以极大地促进晶相转化,使转化过程由6h缩短至0.5h以内。磷酸钙矿物的FTIR和XRD图谱显示出蛋白质特征峰,且矿化后滤液中蛋白含量降至原来的0.5%,表明卵黄高磷蛋白参与了磷酸钙矿物的形成,成为矿物的组成部分之一。不同添加顺序的实验结果显示,卵黄高磷蛋白在DCPD形成之前添加才能够发挥其促进作用,表明与游离钙离子的互作是其调控磷酸钙矿化的关键。作为对照的BSA亦对晶相转化具有促进作用,但其作用较弱且参与模式不同,BSA参与磷酸钙矿物晶相转化后期阶段,而卵黄高磷蛋白参与晶相转化起始阶段,卵黄高磷蛋白在磷酸钙矿化过程中的奇特作用与其高度的磷酸化密切相关。(5)使用0.1、0.2、0.3、0.4mol/L NaOH溶液处理卵黄高磷蛋白(Pv),经超滤分离得到不同去磷酸化的卵黄高磷蛋白：T1、T2、T3和T4,去磷酸化程度分别为2.98%、19.46%、43.39%和71.07%。并采用pH-stat体系研究了其对矿化的影响。卵黄高磷蛋白促进矿化的效果呈浓度剂量关系。通过CD、 FTIR、 XRD、 SEM和荧光光谱研究不同去磷酸化程度的卵黄高磷蛋白对矿化的影响,结果表明磷酸化在矿化反应中起到很重要的作用。去磷酸化后的卵黄高磷蛋白p-折叠结构增加,可以提供矿化模板。去磷酸化程度低的卵黄高磷蛋白由于无序结构减少,吸附矿物能力减弱,含磷量少,结合钙离子能力减弱,从而促进矿化效果减弱。但高浓度碱液处理卵黄高磷蛋白使其水解为了卵黄高磷蛋白磷酸肽,由于活性区域暴露,成核位点增加,显著的促进矿化。总之,促进矿化效果强弱顺序依次为T4>T3>卵黄高磷蛋白﹥T2﹥T1﹥Control。(6)通过碱液部分去磷酸化后再用胰蛋白酶酶解卵黄高磷蛋白,经DEAE离子交换色谱和Sepharose G-25凝胶过滤色谱分离纯化卵黄高磷蛋白磷酸肽(PPP)各组分,SDS-PAGE和CD分析显示PPPO和PPP1可能为卵黄高磷蛋白酶解的小分子片段(N端或C端),而PPP3和PPP4二级结构相似,只是PPP4折叠更多,且PPP3多含10kDa的小分子肽。利用pH-stat体系研究卵黄高磷蛋白磷酸肽各组分对矿化效果的影响,通过CD、 FTIR、 XRD、 SEM和荧光光谱研究发现PPPO、 PPP1、 PPP4促进效果并没有卵黄高磷蛋白强,原因为PPP0和PPP1是小分子肽,不参与矿化；同时,PPP4折叠太多,结构太紧凑,使得促进矿化能力减弱。而PPP3暴露了活性区域,因此促进效果最显著。促进矿化反应效果强弱顺序依次为：PPP3>卵黄高磷蛋白﹥PPP4﹥PPP1﹥Control﹥PPPO。经LTQ MS/MS鉴定可知促进矿化的活性区域为卵黄高磷蛋白核心区域中的D1165-R1258。