研究背景全球目前大约有3.46亿糖尿病患者,其中1型糖尿病又称为青少年糖尿病或胰岛素依赖型糖尿病,占患者总数的10%左右,发病原因主要是胰岛β细胞受损造成胰岛素分泌不足。糖尿病主要以高血糖为临床表现,能够导致的并发症包括:心血管病变,视网膜病变,肾衰竭及神经系统病变,严重的甚至危及患者生命。目前主要的治疗方法是外源性注射胰岛素治疗,但单纯胰岛素治疗并不能有效预防并发症的发生,同时还有引发低血糖昏迷的风险。随着细胞移植技术的不断发展,胰岛细胞移植由于其操作简便、对人体损伤小、能够从生理水平上调控血糖,被认为是最有前景的治疗方法。胰岛细胞移植的过程中会受到很多因素的影响,包括:细胞来源,移植方式,炎症反应等。生物材料的发展为胰岛细胞移植提供了很大帮助,其机理主要是通过半透膜或人工材料将细胞与宿主隔绝。在生物材料中,以组织工程小室技术的应用最为广泛,组织工程小室由于具备了方便观察,对机体损伤小,发生并发症时容易取出等优点,一直是人们研究的热点。本实验小组前期设计了一种多孔的硅胶小室。前期实验结果表明,硅胶小室组织相容性好,小室孔径在1-3mm之间时能够有效的将室内细胞与宿主组织隔绝开,防止宿主组织长入。小室中组织渗液能够为细胞提供充足的营养物质。同时,硅胶小室在植入体内后表面会形成光滑的纤维包膜,纤维包膜中含有丰富的血管网,能够为室内移植物提供营养物质。研究表明在同种异体胰岛细胞移植的过程中炎症反应的发生会导致胰岛细胞高达60%左右的损失,炎症相关信号通路的激活和炎性细胞因子的表达能够影响到胰岛细胞的功能和移植物的长期存活。ang1是炎症反应中一个重要的因子,具有显著的抗炎作用。同时,在血管发育和成熟的过程中也发挥着重要的作用。comp-ang1是公认被用来研究ang1的可溶性异构形式。研究表明,ang1长时间作用时,具有很强的抗炎作用,能够抑制tnf-α的表达,抑制白细胞的粘附。近年来的多项研究表明,ang1在移植领域有着广阔的应用前景,很可能在胰岛细胞移植过程中能够促进胰岛细胞的存活和发挥功能。因此,我们认为comp-ang1联合硅胶小室能够为同种异体胰岛细胞提供一个良好的微环境。研究目的通过研究comp-ang1联合硅胶小室在同种异体胰岛细胞移植中的保护作用及其相关机制,初步探索抗炎因子和物理空间隔离的协同作用在同种异体胰岛细胞移植中的功能,为进一步提高同种异体胰岛细胞移植的存活率,治疗糖尿病,建立新方法,发现新思路。实验方法1.检测多孔硅胶小室对同种异体细胞移植的免疫保护作用1)将孔径为1mm的硅胶小室植入c57bl/6j小鼠背部。2)在纤维包膜形成后将同种异体来源的成纤维细胞植入室内,设置皮下为对照组,检测基质胶混合同种异体成纤维细胞置入小室2周后he切片染色情况。3)将同种异体来源的脾细胞植入到硅胶小室内,通过流式细胞术检测24h、48h后宿主淋巴细胞浸润情况。2.检测同种异体胰岛细胞在组织工程室中的生存情况1)通过腹腔注射stz(200mg/kg)的方法诱导小鼠糖尿病模型。2)实验组:硅胶小室组;对照组:皮下组。3)硅胶小室置入2周后进行同种异体胰岛细胞移植,通过随机血糖检测,腹腔糖耐量实验,大体及组织学观察对移植物存活情况进行评估。3.comp-ang1联合硅胶小室在同种异体胰岛细胞移植中的作用1)腹腔注射stz(200mg/kg)诱导糖尿病小鼠模型。2)实验组:comp-ang1+硅胶小室组;对照组:单纯硅胶小室组,肾包膜组,皮下组。3)硅胶小室置入2周后进行同种异体胰岛细胞移植,通过随机血糖检测,腹腔糖耐量实验,炎性细胞因子检测,移植物生存分析,大体及组织学观察对移植物存活情况进行评估。4.comp-ang1在胰岛移植中改善移植物存活机制的初步研究1)混合同种异体来源的胰岛细胞与受体小鼠淋巴结细胞反应,观察在comp-ang1存在的情况下,小鼠淋巴细胞增殖的情况。2)观察在lps诱导炎症反应导致胰岛细胞凋亡过程中comp-ang1发挥的作用。3)检测包膜及胰岛细胞在comp-ang1存在的情况下炎症通路的变化。研究结果1.多孔硅胶小室对同种异体细胞移植具有免疫隔离保护作用1)多孔硅胶小室在置入小室背部后,组织液能够很快充满硅胶小室。2)硅胶小室置入2周后在硅胶小室表面能够形成结构完整的纤维包膜。3)1mm孔径的硅胶小室能够很好的将移植物与宿主组织隔离。4)室内组织液中炎症相关细胞会随着植入时间的延长而逐渐减少。5)he染色及流式细胞术的结果表明纤维包膜包裹硅胶小室形成的物理空间能够对同种异体来源的成纤维细胞及脾细胞起到一定免疫保护作用。2.同种异体胰岛细胞在硅胶小室中存活良好1)硅胶小室置入糖尿病小鼠背部2周后植入基质胶混合的同种异体胰岛细胞,植入的胰岛细胞能够发挥功能并在植入后3天有效的调控血糖。2)胰岛细胞植入1周后进行腹腔糖耐量实验的结果表明,移植物功能良好。3)胰岛细胞植入2周后的he及免疫荧光的结果表明,植入的胰岛细胞结构完整,胰岛素分泌正常,移植物中未见明显淋巴细胞浸润的情况,同时皮下对照组实验结果表明单纯将同种异体来源的胰岛细胞植入到皮下并不能够有效的控制血糖。3.comp-ang1联合硅胶小室对同种异体胰岛细胞移植的作用1)胰岛细胞植入3天后能够能稳定的控制小鼠血糖变化,移植1周后腹腔糖耐量实验中我们发现单纯硅胶小室及comp-ang1组结果接近正常小鼠,而对照组,肾包膜组小鼠糖耐量的情况较前两组差。2)实验结果表明,comp-ang1能够明显提高移植物的存活状况,comp-ang1联合硅胶小室组与其他组相比,移植物存活时间明显延长。3)胰岛细胞植入5周后的he及免疫荧光的结果表明实验组胰岛细胞结构完整,胰岛素分泌正常,对照组单纯chamber组中胰岛细胞结构破坏,胰岛细胞不能够分泌胰岛素。4)胰岛细胞植入2周后检测硅胶小室中渗液炎症相关细胞因子的含量,检测结果表明comp-ang1组il-1β、il-6、tnf-α的含量明显降低。4.comp-ang1促进移植物存活的分子机制1)comp-ang1能够明显抑制由lps诱导的胰岛细胞凋亡的情况。2)混合同种异体胰岛细胞与小鼠淋巴细胞的实验中发现,在comp-ang1存在的情况下能够明显抑制由同种异体胰岛细胞引起的淋巴细胞增殖。3)westernblot检测结果表明comp-ang1能够降低胰岛细胞及包膜组织中tlr4的表达。结论硅胶小室在置入小鼠体内后,纤维包膜包裹硅胶小室所形成的物理空间对同种异体细胞移植具有一定的免疫隔离保护作用,在同种异体胰岛细胞移植的实验中结果表明,这种纤维包膜加上硅胶小室所形成的物理空间,同种异体来源的胰岛细胞能够在其中存活并发挥功能,时间长达4周,并且未见明显排斥反应的发生。在进一步的研究中,我们发现COMP-Ang1能够很好的抑制胰岛细胞移植过程中炎症反应的发生,降低了影响移植物存活的炎性细胞因子IL-1β、IL-6、TNF-α的含量,有效的延长了移植物的存活时间。在对抗炎作用的深入研究中,我们发现,COMP-Ang1在同种异体胰岛移植中发挥的抗炎作用,很可能是通过抑制胰岛细胞及包膜组织中TLR4信号的表达而实现的。因此,COMP-Ang1是一种良好的,能够提高同种异体胰岛细胞移植生存率的因子,COMP-Ang1联合硅胶小室的协同作用,为同种异体胰岛细胞移植提供了一个新的思路。