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目的:苯并芘(BaP)是一种重要的环境污染物,具有明显的生殖毒性。课题组前期的研究发现,孕早期BaP暴露损害小鼠子宫内膜形态并诱导蜕膜化缺陷。蜕膜化是子宫内膜基质细胞增殖分化形成大的上皮样蜕膜细胞的过程,为胚胎生长和胎盘形成提供空间。蜕膜化的正常进行与细胞周期调节密切相关,但关于BaP对早孕小鼠基质细胞蜕膜化过程中细胞周期的影响尚不清楚。本研究探讨了BaP对蜕膜化过程中基质细胞增殖分化的影响,为进一步研究BaP的生殖毒性提供实验依据。方法:前期实验结果证明0.2mg/kg/d BaP染毒影响了早孕小鼠子宫内膜容受性及蜕膜化过程,导致胚胎着床数下降,因此本实验采用0.2mg/kg/d BaP作为染毒剂量。首先建立BaP染毒孕鼠模型,从妊娠第1天(D1)至第8天(D8),每日给予灌胃处理,分别于孕6、7、8天收取子宫材料,进行以下实验:(1)HE染色观察蜕膜组织形态,Western blot检测蜕膜化标志物BMP2的表达。(2)免疫组化,Real-time PCR和Western blot的方法检测蜕膜组织的增殖(Ki67和PCNA),分化(Prl8a2和Prl3c1)以及多倍体化相关分子(CyclinD3,CDK6和p21)的表达。(3)流式细胞术检测蜕膜组织的DNA含量水平。(4)Western blot,免疫组化的方法检测G1/S转换的相关周期蛋白以及E2F/Rb信号通路相关因子的表达。(5)Western blot,Real-time PCR检测蜕膜组织G2/M期相关周期蛋白以及ATM/ATR激酶相关因子的表达。建立体外人工诱导蜕膜化基质细胞模型:通过分离小鼠基质细胞,免疫荧光检测基质细胞Vimentin的表达(鉴定基质细胞纯度),体外诱导蜕膜化,同时建立BaP染毒细胞模型,进行以下实验:(1)Real-time PCR的方法检测蜕膜细胞分化标志分子Prl8a2和Prl3c1的表达;Western blot检测增殖标志物PCNA的表达。(2)Western blot检测G1/S和G2/M相关细胞周期因子的表达。(3)流式细胞术检测蜕膜细胞的DNA含量。结果:(1)BaP暴露导致蜕膜组织BMP2表达下调,4N和>4N细胞数量减少,损害了小鼠蜕膜化过程。(2)BaP暴露导致增殖标志分子Ki67和PCNA上调,分化标志分子Prl8a2和Prl3c1下调,引起蜕膜化过程基质细胞的增殖分化失衡。(3)BaP处理下调CyclinD3,CDK6和p21,影响蜕膜多倍体化相关因子的表达。(4)BaP处理上调CyclinA(E)/CDK2,CyclinD1/CDK4,和E2F/Rb信号通路相关分子的表达,促进G1/S进程,导致细胞增殖。(5)BaP处理上调CyclinB1/CDK1和pHH3的表达,抑制ATM/ATR激酶的表达,促进G2/M进程。(6)体外诱导基质细胞蜕膜化实验中,证实了基质细胞分离成功以及蜕膜化诱导成功;在BaP处理后Prl8a2和Prl3c1下调;与对照组相比,细胞周期蛋白改变与体内实验基本一致,并且流式细胞术检测结果显示BaP处理组4N和>4N细胞数量下降。结论:由上述的实验结果得出结论:苯并芘暴露促进蜕膜化过程中基质细胞增殖,抑制细胞分化,减少蜕膜多倍体形成,损害小鼠基质细胞蜕膜化过程,提示基质细胞增殖分化平衡失调可能是BaP导致蜕膜化缺陷的重要机制。