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为确定脱落酸(ABA)和H2O2在干旱高温复合胁迫诱导的玉米(Zea mays L.)叶片和根系小热休克蛋白(sHSPs)和抗氧化防护中的作用,本研究以玉米郑单958及ABA缺失突变体vp5为实验材料,首先通过引物设计和。RT-PCR分析筛选出干旱高温复合胁迫诱导产生的sHSPs基因,其次采用ABA抑制剂钨酸钠(T)和H2O2清除剂KI(Ⅰ),通过RT-PCR分析ABA和H2O2对玉米叶片和根中sHSPs和抗氧化防护酶基因表达的影响,最后通过Westernblot分析验证了sHSP26的表达。具体研究结果如下:
1.从NCBI数据库(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)GenBank中查找出玉米sHSPs已发表的全部基因序列,利用软件Dnaman对不同家族的sHSPs基因序列分别进行比对分析,并利用软件Oligo6.0分别在其保守区设计引物,最后通过RT-PCR筛选出诱导型sHSPs基因,本实验筛选出的诱导型sHSPs基因分别有:sHSP16.9、sHSP17.2、sHSP17.4、sHSP17.5、sHSP22和sHSP26。另外还分别对四种抗氧化防护酶的基因设计了引物:过氧化氢酶1(catalase1,CAT1)、抗坏血酸过氧化物酶(cytolic ascorbate peroxidase,cAPX)、谷胱甘肽还原酶1(glutathione reductase1,GR1)和超氧化物歧化酶4(superoxide dismutase4,SOD4)。
2.ABA抑制剂钨酸钠和H2O2清除剂KI预处理结果表明:(1)六种sHSPs基因在玉米叶片中的表达分别都受到T不同程度的抑制,而根中只有sHSP16.9、sHSP17.2、sHSP17.5和sHSP22表达稍微受到抑制,CAT1、cAPX、GR1和SOD4四种抗氧化防护酶基因表达在玉米叶片和根中均受到T明显抑制。(2)与未用100μM ABA预处理的vp5相比,100ⅡM ABA预处理明显增强了四种抗氧化防护酶基因在突变体vp5叶片和根中的表达,但是仅稍微提高了六种sHSPs基因在叶片中的表达和sHSP17.2在根中的表达。(3)KI预处理明显抑制了四种酶基因在玉米叶片和根中的表达,但是稍微抑制了六种sHSPs基因在玉米叶片中的表达和sHSP16.9、sHSP172、sHSP17.5、sHSP22和sHSP26五种基因在根中的表达。
3.Western blot实验检测分析sHSP26的表达,结果显示,在玉米叶片中T和I均明显抑制了sHSP26的表达,而在根中,T对sHSP26的表达几乎没有影响而I仅稍微抑制了sHSP26的表达。
这些研究结果为进一步研究植物抗逆机制及基因克隆奠定基础,并为揭示植物在多胁迫条件下耐逆机理提供重要的科学证据。