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乙型肝炎病毒(hepatitis B virus,HBV)是慢性肝炎的重要病原之一,常导致严重肝病,包括肝硬化和肝细胞癌(hepatocellular carcinoma,HCC)。在HCC形成过程中,其中HBxAg(hepatitis B x antigen)的功能一直是研究热点。在转录水平HBxAg对病毒本身及人类多种基因具有激活及阻遏作用。S100A11蛋白广泛存在于正常人体组织细胞中,该蛋白进入细胞核发挥细胞生长负调节作用。在某些肿瘤细胞中S100A11蛋白的表达量升高[12-14]。而增多的S100A11蛋白从肿瘤细胞的细胞核移位至细胞质。“永生化”细胞中的这种蛋白定位改变可能使其丧失本身的生物学功能。目的本课题旨在研究S100A11蛋白在肝癌细胞系BEL-7402增殖过程中发挥的作用,以及明确该蛋白在正常肝细胞、慢性HBV感染的肝细胞及肝癌细胞中的核质定位分布特点,进一步探讨HBxAg对S100A11基因在转录水平的调节作用。方法1.构建S100A11的真核表达载体(实验组),同时设平行对照,转染肝癌细胞系BEL-7402,筛选稳定表达。通过流式细胞术检测肝癌细胞BEL-7402中处于细胞分裂各周期中的相对细胞数,分析含目的基因质粒组及相应对照组中处于分裂周期中S期的细胞数。采用活细胞发光法检测两组细胞中活细胞数量相对值,绘制细胞生长曲线并进行比较。2.构建HBxAg的真核表达载体及S100A11-promoter荧光素报告质粒,并设平行对照,转染BEL-7402。制备转染后的细胞裂解液,在肝癌BEL-7402细胞中检测HBxAg对S100A11启动子转录活性的影响。用Luciferase法检测报告基因表达。3.通过免疫组织化学技术比较S100A11蛋白在正常肝细胞、慢性HBV感染的肝细胞以及肝癌细胞中的分布情况。构建S100A11绿色荧光素质粒,瞬时转染肝癌细胞系BEL-7402,通过荧光显微镜观察融合蛋白在BEL-7402中的分布。结果1.实验组BEL-7402细胞经流式细胞术检测后发现处于S期的细胞占26.49±1.94%;而平行对照组中处于S期的细胞占30.42±1.62%;野生株BEL-7402中处于细胞分裂周期中S期的细胞占总细胞数的31.40±2.06%。均分细胞后,用活细胞发光法检测细胞增殖情况。结果显示,36 h检测时实验组细胞增殖速率与对照组相比明显降低。2.本实验成功获得含人S100A11基因启动子的荧光素报告载体,且测序证实插入序列与理论序列一致。实验组的转录活性与对照组的转录活性相比降低60%。3.免疫组织化学染色发现,肝癌细胞胞质中S100A11蛋白的量较正常细胞明显增多,慢性乙型肝炎中S100A11蛋白的表达量微弱。而我们强制表达的外源性S100A11蛋白在BEL-7402细胞的细胞核及细胞质中均有分布。结论1.S100A11对肝癌细胞BEL-7402具有明显的生长抑制作用,主要表现为使处于细胞分裂周期中S期细胞数量明显减少。2.成功获得人S100A11基因启动子序列,HBxAg对S100A11基因的转录表达具有抑制作用。提示HBV通过HBxAg可使S100A11蛋白的表达下调,这可能使经该途径发挥的细胞生长抑制作用减弱。3.在HCC的发生发展中,可能存在S100A11蛋白的核质移位现象。慢性乙型肝炎细胞中S100A11蛋白的表达微弱,过表达的S100A11蛋白在BEL-7402细胞中为核质泛表达。