为了探索中黑盲蝽发育过程中基因表达差异及功能,本文利用Illumina HiSeqTM2000测序平台对中黑盲蝽的卵、1龄若虫、3龄若虫、5龄若虫、成虫五个样本分别进行转录组测序。中黑盲蝽的转录组Unigene通过把测序的序列进行无参考基因组的混合拼接获得,并对Unigene进行功能注释和GO、KEGG等蛋白功能分类和代谢途径分析。然后,通过不同龄期中黑盲蝽样品间的转录组Unigene的差异比较,筛选出不同龄期中黑盲蝽样品间的差异基因,并以丝氨酸蛋白酶基因为例,验证该差异基因的功能,为进一步研究其它差异基因的功能奠定了基础。在研究中获得的主要结论如下:(1)中黑盲蝽的发育特性分析其臭腺有两种,即腹部臭腺和胸部臭腺。在不同发育阶段臭腺的位置不同。在若虫期,臭腺开口位于腹部背板第五腹节与第六腹节的节间处;在成虫期,臭腺开口位于后胸。(2)使用Blast方法对拼接得到的中黑盲蝽的57,480个Unigene进行基因功能注释后,共有20,842个Unigene获得基因功能注释,占所有Unigene的36.25%,其中有16,872个注释到Nr数据库,有16,014个注释到GO数据库,有12,119个注释到Swiss-Prot数据库,有5,495个Unigene注释到257条KEGG代谢通路中,这些被注释的基因将为以后研究中黑盲蝽的基因功能调控、进行系统发育分析的分子标记和正常的生理代谢研究提供了巨大的数据资源和先进的研究手段。此外,还有63.75%的Unigene未能获得明确的功能信息,这些Unigene将为挖掘新的基因提供非常重要且有意义的信息。(3)在得到中黑盲蝽各个基因的FPKM值后,筛选了不同龄期中黑盲蝽样品之间的差异基因。1龄若虫与卵之间,共获得了4,460个差异表达基因,3龄若虫与卵之间,共获得了4,785个差异基因,5龄若虫与卵之间,共获得了4,595个差异基因,成虫与卵之间,共获得了4,787个差异基因,1龄若虫与成虫之间,共获得了2,830个差异基因,3龄若虫与成虫之间,共获得了2,797个差异基因,5龄若虫与成虫之间,共获得了2,890个差异基因,3龄若虫与1龄若虫之间,共获得了200个差异基因,5龄若虫与3龄若虫之间,共获得了796个差异基因,5龄若虫与1龄若虫之间,共获得了900个差异基因。这些差异表达基因,为鉴定中黑盲蝽不同龄期生长发育的相关基因及其相互作用提供非常有价值的信息。(4)对以上差异表达基因进行的GO功能分类及其富集分析结果显示:在1龄若虫与卵之间,这些获得功能注释的基因,主要参与了单个有机体碳水化合物代谢过程、胞外区、氧化还原酶等过程;在3龄若虫与卵之间,这些获得功能注释的基因,主要参与了碳水化合物代谢过程、细胞核、结构分子活性等过程;在5龄若虫与卵之间,这些获得功能注释的基因,主要参与了细胞、细胞器、绑定等过程;在成虫与卵之间,这些获得功能注释的基因,主要参与了蛋白质水解、呼吸链复合物iv、催化活性等过程;在1龄若虫与成虫之间,这些获得功能注释的基因,主要参与了氧化还原过程、胞外区、水解酶活性、肽酶活性等过程;在3龄若虫与成虫之间,这些获得功能注释的基因,主要参与了水解酶活性、胞外区、蛋白质水解等过程;在5龄若虫与成虫之间,这些获得功能注释的基因,主要参与了水解酶活性、细胞间粘附、微管蛋白复合体等过程;在1龄若虫与3龄若虫之间,这些获得功能注释的基因,主要参与了结构分子活性、多糖代谢过程、角质层的结构组成等过程;在5龄若虫与3龄若虫之间,这些获得功能注释的基因,主要参与了几丁质代谢过程、角质层结构组成、结构分子活性等过程;在1龄若虫与5龄若虫之间,这些获得功能注释的基因,主要参与了多糖代谢过程、胞外区、结构分子活性、水解酶活性等过程。获得注释的差异基因在中黑盲蝽不同龄期的表达比例跟其生长发育需求有一定的关系。(5)差异表达基因的keggpathway注释和富集分析结果显示:在1龄若虫与卵之间,存在差异表达基因的代谢通路有156条,差异基因显著富集的途径则有11条;在3龄若虫和卵之间,159条存在差异表达基因的代谢通路,有13条显著富集的代谢通路;在5龄若虫和卵之间,153条存在差异表达基因的代谢通路,差异基因显著富集的代谢通路有10条;在成虫和卵之间,154条存在差异表达基因的代谢通路,显著富集的代谢通路有15条;在1龄若虫和成虫之间,137条存在差异表达基因的代谢通路,显著富集的代谢通路有7条;在3龄若虫和成虫之间,138条存在差异表达基因的代谢通路,显著富集的代谢通路有6条;在5龄若虫和成虫之间,142条存在差异表达基因的代谢通路,显著富集的代谢通路有3条;在1龄若虫和3龄若虫之间,31条存在差异表达基因的代谢通路,显著富集的代谢通路有2条;在5龄若虫和3龄若虫之间,89条存在差异表达基因的代谢通路,显著富集的代谢通路有4条;在5龄若虫和1龄若虫之间,104条存在差异表达基因的代谢通路,显著富集的代谢通路有3条。(6)根据转录组测序拼接结果,设计引物和采用race的技术,在中黑盲蝽中获得丝氨酸蛋白酶的全长cdna序列,该基因命名为asjsp,全长cdna长度为958bp,开放阅读框为885 bp,推测编码295个氨基酸,推测获得的克隆蛋白序列属于丝氨酸蛋白酶家族。