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1、建兰花叶病毒(CymMV)和齿兰环斑病毒(ORSV)是目前侵染蝴蝶兰最多、对蝴蝶兰生产造成严重危害的两种主要病毒,两种病毒复合侵染会影响蝴蝶兰的商品价值,因此建立一套快速、准确的蝴蝶兰病毒病检测技术体系,对组培脱毒、种苗检测具有重要的理论和现实意义。本研究就两种病毒的检疫检验方法进行研究,取得了以下成果。
1)本研究报道了CymMV和ORSV的4种分子检测技术,分别是:ELISA检测技术、一步法RT-PCR检测技术(One-step RT-PCR)、免疫捕获RT-PCR技术(immunocapture-RT-PCR,IC-RT-PCR)、SYBR Green荧光定量RT-PCR技术。检测结果表明,ELISA方法检测灵敏度为0.1 mg/ml;RT-PCR的方法检测灵敏度为1ng/μ L;IC-RT-PCR和SYBR Green荧光定量RT-PCR的检测灵敏度为0.04-0.1 ng/μ L。ELISA方法检测样本量多;RT-PCR检测灵敏度较ELISA高;IC-RT-PCR和SYBR GreenRT-PCR的检测灵敏度为RT-PCR检测灵敏度的10倍左右,IC-RT-PCR可以在不提纯病毒RNA的情况下实现对病毒的检测,SYBR Green荧光定量RT-PCR无需对PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳检测,缩短检测时间,但成本较高。
2) ELISA检测结果表明:上海孙桥农业开发区蝴蝶兰生产主要受建兰花叶病毒和齿兰环斑病毒的侵染,在检测的5个品种中有4个品种存在两种病毒复合侵染现象,复合侵染率达到55.2%。不同品种病毒感染率均达到了70%以上。5个品种均不同程度的携带建兰花叶病毒,其中超级火鸟、双龙、631检测的50株材料全部携带CymMV,V31和小花蝴蝶兰均有62%的植株感染了CymMV。5个品种中有4个品种均不同程度的携带ORSV,其中超级火鸟、双龙检测的50株材料全部携带ORSV,V31和小花蝴蝶兰分别有38%和68%的植株感染了ORSV。叶片、花、花梗及根段均检测到CymMV病毒,叶片的OD值高于其他部位,根段的OD值最低。
3)采用RT-PCR技术从蝴蝶兰品种V31中检测到建兰花叶病毒(CymMV)。以带毒植物的RNA作为模板,通过一步法反转录-聚合酶链式反应(reverse transcription polymerase chain reaction,RT-PCR)扩增得到571bp的目的片段。将目的片段转入大肠杆菌(E coli)并进行测序。序列测定结果与其他CymMV的外壳蛋白(CP)基因序列比较,发现核苷酸同源性可达97%以上,证明已成功地得到了CymMV的CP基因。依据CymMV的CP核苷酸序列同源性建立了CymMV的系统进化树并对不同地域的分离物进行了亲缘关系的分析。
4)采用RT-PCR技术从蝴蝶兰品种V31中检测到齿兰环斑病毒(ORSV)。以带毒植物的RNA作为模板,通过一步法反转录-聚合酶链式反应(reverse transcription polymerase chainreaction,RT-PCR)扩增得到440bp的目的片段。将目的片段转入大肠杆菌(E.coli)并进行测序。序列测定结果与其他ORSV的外壳蛋白(CP)基因序列比较,发现核苷酸同源性可达97%以上,证明已成功地得到ORSV的CP基因。依据ORSV的CP核苷酸序列同源性建立了ORSV的系统进化树并对两者的不同分离物进行了亲缘关系的分析。
5)依据CymMV外壳蛋白基因序列设计合成SYBR Green qRT-PCR引物,以带毒蝴蝶兰叶片总RNA为模板,通过一步法RT-PCR扩增得到目的条带,筛选出用于SYBR GreenqRT-PCR的引物CymMV12,片段大小为101bp。建立SYBR Green实时荧光RT-PCR检测建兰花叶病毒的反应体系。此方法的标准曲线为Ct=-7.65671g(CymMV)+17.135,相关系数为0.9792,检测质粒最低浓度为0.0391ng/μ L。
2、采用PCR方法对草莓镶脉病毒(SVBV)进行检测,从北京甜查理中检测到SVBV,PCR扩增到278bp的目的片段,将目的片段转入大肠杆菌(E.coli)并进行测序。序列测定结果与其他SVBV的外壳蛋白(CP)基因序列比较,发现核苷酸同源性可达89%以上,证明已成功地得到了SVBV的CP基因。采用ELISA的方法对上海孙桥草莓基地的草莓轻型黄边病毒(SMYEV)和草莓潜环斑病毒(SLRSV)进行检测,未发现携带病毒植株。采用RT-PCR方法对草莓皱缩病毒(SCV)和草莓斑驳病毒(SMoV)进行检测,未发现携带病毒植株。
3、以甘蔗脱毒茎尖及茎尖分化的外植体为试材,研究了基因型、培养基类型、激素及吸附剂活性炭对甘蔗茎尖及外植体生长分化的影响。结果表明,不同甘蔗品种成活率及褐化率不同;MS改良培养基(MS培养基中硝酸铵用量减少1/4)较MS培养基和B5培养基利于甘蔗材料的生长;培养基中添加激素6-BA5.0mg/L有利于材料的分化,NAA的添加不利于甘蔗外植体的分化;活性炭添加量为0.8g/L时可有效吸附酚类物质,促进外植体分化。
4、通过在马铃薯品种荷兰15号、荷兰3号和紫色马铃薯脱毒苗培养基中添加不同浓度的6-BA、NAA及矮壮素(CCC),观察记录植入茎段的生长分化情况,并统计株高、增殖系数、总重量、茎重、叶数、根数、根长、是否结球及分化愈伤组织,研究是否使用植物生长调节剂及使用浓度对马铃薯脱毒试管苗繁殖情况的影响。结果表明:适合马铃薯试管苗工厂化繁殖的最佳培养基为1/2 MS+矮壮素100 mg/1+3%蔗糖+卡拉胶8g/l,为快速、低成本的繁殖健壮试管苗打下基础。