结肠癌是一种好发于结肠部位、比较常见的消化道恶性肿瘤，是目前公认的全球四大致命癌症之一。随着年纪的增加，结肠癌的发病率也是逐渐增加的；并且发病率最高的人群是在41-65岁之间。目前，结肠癌的治疗情况较好，但是术后病人的生活质量较差。结肠癌根据其形态和组织学的不同也有不同的分型情况。对于不同的结肠癌采取的治疗手段也是各不相同的。总体来说，最常用的治疗手段是常规的手术切除，其次是采取放疗和化疗进行进一步的辅助治疗，最后是现目前较热门的分子靶向治疗和免疫治疗。但是，现有的分子靶向治疗的靶向药物只有 EGFR 单克隆抗体和抗血管生成剂两种。因此，寻找新的治疗靶点，以求改善结肠癌患者的治疗情况是特别急切的。在本研究中，我们主要探究结肠癌细胞在体外和小鼠模型中的增殖机制，希望能够抑制结肠癌细胞的增殖和结肠癌的发生和发展，为外科手术和后续的靶向治疗提供一定的理论依据和帮助。　　DOT1L是一个在进化上比较保守的蛋白，也是首个被发现的无SET结构域的组蛋白赖氨酸甲基化转移酶，并且只能甲基化在核小体中的组蛋白H3。大量的研究证实，DOT1L虽然没有SET结构域，但是它的催化机制和含有SET结构域的甲基转移酶相似。DOT1L 在人类 MLL 重排急性淋巴细胞白血病中，通过使组蛋白H3K79发生甲基化导致MLL-AF4基因表达，最后促使白血病的发生，证实了DOT1L可能是治疗白血病的一个关键的基因。到目前为止，多个研究结果也证明了DOT1L在乳腺癌、神经母细胞瘤、卵巢癌等癌症的发生和发展中也扮演着重要的角色。我们的主要研究结果如下：　　1.DOT1L在结肠癌细胞中普遍表达，并且和结肠癌患者的预后密切相关　　我们利用大数据网站分析 DOT1L 在结肠癌病人中的表达情况发现，DOT1L表达量越高，病人的生存预后越低；表达量越低，病人的预后更好。同时，我们利用 RT-PCR 和 Western blot 实验在结肠癌细胞系 HCT116、HCT15、SW480 和SW620中检测发现，DOT1L在结肠癌细胞系中都有表达。利用免疫组化实验也发现，在结肠癌的组织芯片中DOT1L在结肠癌组织中的表达量要高于正常的结肠组织。因此，我们结合数据库分析得到的结果分析猜测DOT1L在结肠癌的发生和发展中可能扮演着一个癌基因的角色。　　2.DOT1L影响结肠癌细胞的细胞生长、细胞增殖和成瘤能力　　我们对 DOT1L 在结肠癌中是否是充当一个癌基因的角色进行进一步的验证，我们首先利用慢病毒介导的shRNA干涉技术降低DOT1L的表达，并通过qRT-PCR和Western blot实验检测DOT1L的下调情况。然后，选择DOT1L特异性抑制剂EPZ004777 和干涉 DOT1L 互为对照进行后续的实验。在下调 DOT1L 的 SW480和HCT116细胞和EPZ004777处理的SW480和HCT116细胞中进行相关的细胞增殖实验。我们利用MTT实验和Brdu荧光标记实验检测结肠癌细胞增殖情况，结果显示结肠癌细胞的增殖能力明显受到抑制。然后利用软琼脂克隆形成实验和建立小鼠成瘤模型来检测DOT1L在对结肠癌细胞的增殖和成瘤能力的影响，发现抑制DOT1L的表达，结肠癌细胞的成瘤能力也受到抑制。同时小鼠中的肿瘤组织进行了H&E、免疫组化，发现干涉DOT1L后的细胞和用抑制剂EPZ004777处理过后形成的肿瘤明显要小于对照组，而且其相对应的DOT1L和Ki67的表达情况也明显降低。因此，这些结果也证实了抑制DOT1L的表达能够抑制结肠癌细胞的细胞生长、增殖和克隆形成能力。　　3.DOT1L影响结肠癌细胞的细胞周期进程　　为了进一步的探究DOT1L是如何来影响结肠癌细胞的生长。我们利用流式细胞仪检测下调 DOT1L 的结肠癌细胞和用 EPZ004777 处理过后的结肠癌细胞，结果显示结肠癌细胞的细胞周期阻滞在 S 期。同时检测其对应的相关周期蛋白的表达情况，结果显示和细胞周期S期阻滞的蛋白CDK2、CyclinA2等蛋白的表达也是明显下降。抑制DOT1L的表达，使结肠癌细胞的细胞周期阻滞在S期，进一步的说明了DOT1L能调控结肠癌细胞的细胞周期进程。　　4.DOT1L介导的H3K79me2调控c-Myc的表达　　为了研究 DOT1L 和细胞周期之间的关系，我们通过阅读大量的文献发现， DOT1L和c-Myc之间密切相关。因此，我们利用RT-PCR和Western blot实验检测发现c-Myc的RNA水平和蛋白水平都有下降。同时，利用蛋白免疫共沉淀实验发现DOT1L和c-Myc能够直接结合，证明DOT1L和c-Myc密切相关。为了进一步的验证DOT1L和c-Myc之间的关系。我们在干涉DOT1L的SW480和HCT116细胞中过表达c-Myc，通过MTT、BrdU、Soft Agar等实验发现结肠癌细胞的增殖能力和成瘤能力得到了一定程度的恢复。流式细胞仪检测细胞周期也发现细胞周期阻滞也在一定程度上降低，而且Western blot实验检测相关的周期蛋白也得到了一定的恢复。　　为了深入的探究DOT1L和c-Myc之间的关系，我们了解到DOT1L能够催化H3K79发生单甲基化、二甲基化和三甲基化，而H3K79me2已经被证实能够激活相关基因的转录。为了确认H3K79me2和c-Myc之间的关系，我们在c-Myc启动子区域内设计了相关的引物，并利染色质免疫共沉淀实验发现H3K79me2在c-Myc启动子上的-6682~+284区域上富集。因此，我们确定了DOT1L是通过催化H3K79发生二甲基化来抑制 c-Myc 的表达，从而引起细胞周期阻滞，进而抑制结肠癌细胞的增殖。　　综上所述，DOT1L在结肠癌细胞中普遍表达，并且和结肠癌病人的预后呈负相关；在结肠癌细胞中，DOT1L 通过介导 H3K79 发生甲基化来转录激活 c-Myc的表达，从而促使细胞周期能够顺利完成，促进结肠癌的生长和结肠癌细胞增殖。因此，本研究证实了 DOT1L在结肠癌中是扮演着一个癌基因的角色，为 DOT1L作为一个新的治疗结肠癌的靶点提供了理论基础和意义。