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颠茄(Atrop belladonna L.)是茄科颠茄属多年生草本药用植物,其主要次生代谢产物为托品烷类生物碱(Tropane Alkaloids,TAs)。莨菪碱和东莨菪碱是TAs中最为重要的两种生物碱,这两种物质作为抗胆碱药作用于副交感神经而广泛运用,市场需求十分巨大。目前,TAs主要从茄科植物颠茄Atropa belladonna、曼陀罗Datura stramonium和莨菪Hyoscyamus niger中提取,而颠茄又是莨菪碱和东莨菪碱含量最主要的商业药源植物,是药典收录的药源植物之一。但野生型颠茄中TAs含量很低,莨菪碱和东莨菪碱的质量分数分别为0.02%~0.17%(干重)和0.01%~0.08%(干重),其产量远远不能满足市场的需求。此外,TAs化学合成困难且昂贵,无法进行大规模的人工合成。近年来,随着代谢工程的快速发展,使得通过基因工程的方法遗传改造TAs生物合成途径,进而提高茄科植物中TAs的含量成为可能。精氨酸脱羧酶是生物碱生物合成上游途径上的关键酶之一,本研究基于已有EST测序结果,采用RACE技术首次从颠茄中克隆获得两个精氨酸脱羧酶(Arginine Decarboxylase,ADC)基因,分别命名为Ab ADC1和Ab ADC2。生物信息学分析结果显示,Ab ADC1基因全长c DNA为2817bp,包含492bp的的5’非翻译区(5’Untranslated region,5’-UTR)、186bp的3’非翻译区(3’Untranslated region,3’-UTR)和2139bp的完整开放阅读框(open reading frame,ORF),编码712个氨基酸的多肽;Ab ADC2基因全长c DNA为2992bp,包含569bp的5’非翻译区(5’Untranslated region,5’-UTR)、275bp的3’非翻译区(3’Untranslated region,3’-UTR)和2148bp的完整开放阅读框(open reading frame,ORF),编码715个氨基酸的多肽。氨基酸序列分析表明,Ab ADC1氨基酸序列与马铃薯(Solanum tuberosum)的ADC序列一致性最高,为89%,Ab ADC2的氨基酸序列与曼陀罗(Datura.Stramonium)的ADC序列一致性最高,达到90%。蛋白二级结构预测表明,Ab ADC1编码蛋白包含36.52%的α-螺旋、16.15%的延伸链和47.33%的无规则卷曲;Ab ADC2编码蛋白包含35.38%的α-螺旋、17.34%的延伸链,和47.27%的无规则卷曲。信号肽和转运肽预测显示,Ab ADC1和Ab ADC2都不存在信号肽,属于胞质蛋白,Ab ADC1主要定位于细胞质;Ab ADC2主要定位于细胞质膜。由进化树发现,Ab ADC1与曼陀罗的精氨酸脱羧酶亲缘关系较近,而Ab ADC2与烟草的精氨酸脱羧酶的亲缘关系较近。组织表达谱分析表明,Ab ADC1特异性的在须根中表达量最高,其次为主根和嫩茎;Ab ADC2特异性的在主根中表达量最高,其次为须根。用发根农杆菌C58C1侵染颠茄叶片,获得颠茄发根。将发根在250m L三角瓶中悬浮培养一个月后,分别用100 m M Na Cl和低温处理,在四个时间点取样,检测Ab ADC1和Ab ADC2基因的表达量和生物碱的含量。结果表明,在Na Cl处理项,莨菪碱含量无明显变化,东莨菪碱含量有显著性降低;在冷处理项,莨菪碱含量仅在处理4h时有显著性降低,其它时间点无显著性变化,东莨菪碱含量在各时间点均无显著性变化。Ab ADC1和Ab ADC2基因的表达量在各种处理时都降低,该结果与腐胺合成途径上另一关键酶基因Ab ODC2的表达情况正好相反,该基因在处理4h时都有显著性提高。由此可以推测,在颠茄中,非生物胁迫可能会抑制精氨酸脱羧酶基因的表达,促进鸟氨酸脱羧酶基因的表达,进而使腐胺的合成量增加,但对生物碱的合成基本无影响。选择PHINNIBAL作为中间载体,PBIN19作为表达载体,获得因RNA干扰导致Ab ADC1和Ab ADC2基因分别沉默的重组质粒:PBIN19-Ab ADC1和PBIN19-Ab ADC2。将构建成功的两个重组质粒及空质粒PNIN19分别转入发根农杆菌C58C1,获得工程菌:C58C1-PBIN19-Ab ADC1、C58C1-PBIN19-Ab ADC2和C58C1-PBIN19。用构建成功的工程菌侵染颠茄叶片获得转基因发根,将阳性克隆扩大培养后测定基因的表达量和生物碱含量,分析精氨酸脱羧酶基因与生物碱含量的关系。本研究首次克隆并获得了颠茄精氨酸脱羧酶家族中的两个功能基因,并分别进行了生物信息学分析、组织表达谱分析、诱导谱分析、进化树分析及功能验证,为研究颠茄托品烷类生物碱的代谢途径提供了重要候选功能基因。