目的：本课题组的前期研究发现,当归芍药散提取部位JD-30对多种AD模型动物的学习记忆功能、突触可塑性(LTP)和神经元损伤有明显的改善作用。在作用机制方面,JD-30可以降低SAMP8脑内的Aβ含量和沉积,可以上调SAMP8海马中表达下降的A1受体,可以抑制Aβ的聚集和纤维化,可以抑制Aβ引起的细胞凋亡,可以抑制小胶质细胞的炎性反应等。为进一步明确JD-30发挥神经保护作用的物质基础和作用机理,本课题从JD-30最主要的两个成分芍药苷和芍药内酯苷的神经保护作用及作用机制方面着手,利用AD细胞模型和动物模型,考察芍药苷和芍药内酯苷的神经保护作用,并以AD发病的腺苷受体失衡假说为理论依据,在分子水平探讨芍药苷和芍药内酯苷与腺苷受体的相互作用,在细胞和整体动物水平探讨药物的神经保护作用及调节腺苷受体平衡的作用,以阐明药物的神经保护机制。方法：1.JD-30成分分析及质量控制本部分实验采用HPLC/MS总离子流色谱图分析等方法,对JD-30成分分析并对不同批次提取JD-30进行质控,确定实验的一致性。2.JD-30及其主要成分的神经保护作用研究及作用途径探索检测药物对细胞活力的影响时,以1×105个/ml的密度接种细胞于96孔板中,给予相应处理后,采用CCK-8检测细胞活力。检测药物对细胞凋亡的影响时,以1×105个/ml的密度接种细胞于6孔板中,处理后采用磷脂酰丝氨酸外翻分析(Annexin V法)检测细胞凋亡。以及Th-T结合实验,考察JD-30及其主要成分芍药苷和芍药内酯苷对Aβ损伤PC12细胞的作用及体外药物Aβ聚集的抑制作用。采用AlphaLISA检测TNF-α水平的方法,观察药物对小胶质细胞BV-2细胞激活后TNF-α分泌的影响。3.药物对AD模型动物学习记忆功能的影响动物分为8组,分别灌胃给予JD-30(14mg/kg)、芍药苷(8mg/kg)、芍药内酯苷(4mg/kg)、芍药苷和芍药内酯苷2：1配伍(8mg/kg+4mg/kg)、芍药苷和芍药内酯苷8：1配伍(8mg/kg+1mg/kg、白芍总苷(5mg/kg)。行为学实验选择被动回避实验——跳台实验考察实验动物被动回避能力。采用Morris水迷宫实验考察实验动物空间记忆能力。4.药物改善AD模型动物学习记忆功能机理研究本部分通过尼氏染色观察了药物对SAMP8脑内神经元损伤的影响,通过免疫组织化学染色观察了药物对SAMP8小鼠脑组织小胶质细胞的影响。并采用RT-PCR技术检测了SAMP8和SAMR1脑中腺苷Al和A2a受体mRNA表达。5.药物与腺苷受体的作用方式研究本部分实验采用放射性受体配体结合、生物膜层干涉技术及计算机分子动力学多种实验技术方法,对JD-30主要成分芍药苷及芍药内酯苷的药理作用及作用机理进行渐进式研究。结果：1.JD-30成分分析及质量控制结果显示,JD-30主要成分有芍药苷、芍药内酯苷、白芍苷R1、4α-羟基芍药苷、苯甲酰芍药苷亚硫酸酯、芍药苷亚硫酸酯、去苯甲酰芍药苷、白芍新苷、4-0-乙基芍药苷、E-松柏苷、淫羊藿次苷F2、4’’-羟基芍药苷、丁香苷、苯甲酰芍药苷、芍新苷、氧化芍药苷、槲皮素等。其中芍药苷和芍药内酯苷分别占JD-30总含量的60.83%和8.06%,总和为68.89%,且不同批次芍药苷和芍药内酯苷总和基本一致。2.JD-30及其主要成分的神经保护作用研究及作用途径探索(1)JD-30及其主要成分对Aβ损伤PC12细胞的作用比较根据前期研究结果,JD-30对Aβ所致的神经损伤有比较明显的改善作用,为此,我们进行了药物对Aβ25-35损伤PC12细胞活力检测、早期凋亡的检测以及Th-T结合实验,考察JD-30及其主要成分芍药苷和芍药内酯苷对Aβ损伤PC12细胞的作用及体外药物Aβ聚集的抑制作用。结果显示,在细胞活力检测上,芍药苷(25、50、100μM)和芍药内酯苷(12.5、25、50μ M)作用24h后,对Aβ25-35降低PC12细胞的吸光度值亦无明显影响,但与芍药苷和芍药内酯苷不同,JD-30(25、50、100mg/L)可以明显减轻与其共孵育后的Aβ25-35所致的PC12细胞活力降低。对PC12细胞早期凋亡的检测结果显示,与正常对照组相比,20μ M Aβ25-35作用后的PC12细胞早期凋亡率明显升高；给予Aβ25-35前1h预先给予JD-30(100mg/L),芍药苷(100μ M)和芍药内酯苷苷(50μ M)对PC12的早期凋亡率均有一定的降低,JD-30组的早期凋亡率更是已接近正常对照组。Th-T结合实验结果显示,JD-30以及另一以芍药苷为主要成分的上市药物白芍总苷(增加英文全称,TGP)对Aβ1-42聚集以及Zn2+促进的Aβ1-42聚集均有明显的抑制作用,而芍药苷和芍药内酯苷则无此作用。(2)药物对多种AD细胞模型细胞活力损伤的影响此部分实验采用CCK-8法检测细胞活力的方法。首先结合多种AD发病假说,我们建立了包括氧化应激、过磷酸化、过度兴奋性、应激、缺氧、去极化等不同类型的细胞损伤模型,进而观察药物对多种因素损伤PC12及SH-SY5Y细胞活力的影响。结果表明,各药物在各浓度对皮质酮(CORT)、硝普钠(SNP)、MSG、KCl损伤的PC12及SH-SY5Y细胞活力无改善作用,JD-30、TGP浓度在100μ g/ml时对H202、Na2S204损伤的细胞活力有改善作用,而单独给予PF、AF无改善作用。(3)药物对LPS诱导BV-2细胞激活的影响本实验采用AlphaLISA检测TNF-α水平的方法,观察药物对小胶质细胞BV-2细胞激活后TNF-α分泌的影响。结果表明,给予LPS刺激后,BV-2细胞TNF-α分泌明显升高,给予有抗炎作用的腺苷后,对LPS引起的细胞TNF-α分泌升高有抑制作用；当芍药苷和芍药内酯苷按8：1配伍(80uM+10μM)时,对LPS诱导的细胞TNF-α分泌升高有抑制作用,而单独给予PF、AF及JD-30无抑制作用。3.芍药苷和芍药内酯苷对AD模型动物学习记忆功能的影响(1)药物对SAMP8学习记忆功能的影响快速老化模型小鼠(SAM-prone/8, SAMP8)是目前公认的较为理想的AD模型动物,SAMP8表现为增龄性的学习记忆功能衰退,而其对照动物抗快速老化模型小鼠SAM-resistance/1(SAMR1)则表现为正常的学习记忆功能。本研究选择5-6月龄雄性SAMP8为研究对象,灌胃给予JD-30(14mg/kg)、芍药苷(8mg/kg)、芍药内酯苷(4mg/kg)、芍药苷和芍药内酯苷2：1配伍(8mg/kg+4mg/kg)、芍药苷和芍药内酯苷8：1配伍(8mg/kg+l mg/kg)、白芍总苷(5mg/kg),并选择同月龄的SAMR1作为其正常对照动物。连续给药8周后开始进行行为学实验。结果显示,在给药期间,各组动物体重变化没有差异；在空间探索实验中,SAMP8初次到达原站台位置所需的时间明显延长(p<0.01),60s内探索游过原站台位置的次数明显减少(p<0.01)。各给药组与SAMP8对照组相比,第2-5天的登台潜伏期有不同程度的缩短,芍药苷和芍药内酯苷8：1配伍组可以明显缩短SAMP8初次到达原站台位置所需的时间(p<0.05),而JD-30给药组与SAMP8组无统计学差异。提示,P/A-2组可以改善SAMP8的空间学习记忆功能障碍,且这一作用要强于JD-30。(2)芍药苷和芍药内酯苷及配伍对东莨菪碱致痴呆动物学习记忆功能的影响在上述研究的基础上,我们继续考察了芍药苷和芍药内酯苷及其不同比例配伍对东莨菪碱所致痴呆动物学习记忆功能的影响。实验选用KM雄性小鼠,随机分组。分别腹腔给予芍药苷(8mg/kg)、芍药内酯苷(4mg/kg)、芍药苷和芍药内酯苷2：1配伍1组(P/A-1组)(8mg/kg+4mg/kg)、芍药苷和芍药内酯苷8：1配伍2组(P/A-2组)(8mg/kg+1mg/kg)(药物均溶于无菌生理盐水),每天一次,给药3天,末次给药后进行跳台实验环境适应,24h后进行跳台测验,同时在实验第二天进行Morris水迷宫实验。结果显示,在被动回避实验(跳台实验),90min短期记忆：模型组潜伏期明显下降,各给药组中,PF组和P/A-2组有改善趋势,但无统计学意义,在Morris水迷宫实验各组无明显差异。上述结果,提示药物对东莨菪碱致痴呆动物学习记忆功能无改善作用。4.药物改善AD模型动物学习记忆功能的机理研究(1)药物对SAMP8锥体神经元损伤及小胶质细胞的激活的影响神经元数量减少和小胶质细胞的异常激活是AD发病的原因,为此,本部分通过尼氏染色观察了药物对SAMP8脑内神经元损伤的影响,通过免疫组织化学染色观察了药物对SAMP8小鼠脑组织小胶质细胞的影响尼氏染色结果显示,SAMR1海马的锥体细胞层结构完整,神经元排列整齐,胞体清晰、饱满；而SAMP8的锥体神经元则明显受损,锥体细胞层结构絮乱稀疏,且神经元细胞数目明显减少,胞体聚缩；P/A-2组与模型组比较,SAMP8海马的锥体神经元损伤明显减轻,锥体细胞层结构基本完整,神经元排列整齐,胞体清晰、饱满,凋亡细胞明显减少。从免疫组化染色结果可以看出,SAMR1组、PF组、AF组、P/A-2组、TGP组的总小胶质细胞数量较少,多数以非激活态存在；模型组、JD-30组、P/A-1的总小胶质细胞量较多,多数以激活态为主,从以上结果可以看出,该结果与尼氏染色相对应。综上所述,芍药苷和芍药内酯苷8：1配伍可以阻止神经元损伤和小胶质细胞异常激活,从而发挥改善动物学习记忆功能障碍的作用。(2)药物对SAMP8脑内腺苷A1和A2a受体mRNA表达的影响本研究采用RT-PCR技术检测了SAMP8和SAMR1脑中腺苷A1和A2a受体mRNA表达,结果显示,相对于同月龄SAMR1,7-8月龄SAMP8海马中的腺苷A1和A2a受体、皮层中的腺苷A2a受体mRNA表达有一定下调,而在皮层中腺苷A1受体基因的表达在SAMP8和SAMR1间无明显差异。各给药组对SAMP8海马总的腺苷A1受体mRNA的表达有一定的上调,但无统计学差异。5.芍药苷和芍药内酯苷与腺苷受体的作用方式研究腺苷受体参与维持神经内环境稳态,腺苷受体的失衡,尤其是A1受体介导抑制作用的减弱和A2a受体介导兴奋作用的增强在阿尔茨海默病(AD)发病中发挥了重要作用,调节脑内的腺苷受体失衡是重要的AD防治手段之一。受体配体结合实验结果显示,芍药苷和芍药内酯苷在1-1000μ M之间对腺苷A1受体与DPCPX的结合无竞争抑制,对腺苷A2a受体与CGS21680的结合无竞争抑制,但不能排除与腺苷受体其他位点结合的可能性。生物膜层表面干涉技术结果发现,加入15-500μ M的药物后,结合曲线与本底值无明显变化,提示药物与测试用的A1和A2a受体无明显结合,但受所用材料的限制,这一结果尚难以定论。计算机分子动力学结果提示,芍药苷与非选择性腺苷受体激动剂NECA的作用方式类似,可与A1受体第4位的TYR和第262位的THR形成氢键；芍药苷与非选择性腺苷受体拮抗剂CGS-15493、选择性A2a受体拮抗剂ZM241385以及咖啡因的作用方式均类似,可与A2a受体第168位的PHE形成Pi-Pi反应。上述结果提示,芍药苷可能兼具激动A1受体和拮抗A2a受体的作用。结论：1.在细胞水平,JD-30在可以改善缺氧和氧化应激细胞模型的活力损伤,芍药苷和芍药内酯苷的配伍对BV-2细胞激活有明显抑制作用；2.在动物水平,芍药苷和芍药内酯苷以8：1的比例(剂量8+1mg/kg)配伍配伍具有潜在的抗AD作用,保护神经元损伤和减轻小胶质细胞激活可能是其发挥抗AD作用的主要机理,同时作用于神经元和小胶质细胞可能与药物可以同时激活腺苷A1受体和抑制A2a受体有关；3.配伍组对AD模型动物有改善作用而对AD模型细胞无作用,提示药物作用需要动物内环境的整体调节。总之,本研究结果提示,芍药苷、芍药内酯苷与JD-30作用有相同之处,也有不同之处。芍药苷和芍药内酯苷配伍可以改善SAMP8的学习记忆功能障碍,可以保护神经元损伤和胶质细胞激活等,因此有进一步研究开发的前景。