[目的]　　 1.探讨急性ITP是否为Th1/Th2细胞失衡相关的自身免疫病。研究急性ITP患者外周血中Th细胞相关细胞因子INF-γ、IL-2、IL-10和IL-13的水平,Th细胞相关转录因子T-bet和GATA-3 mRNA的表达情况,探讨急性ITP的Th细胞的偏移方向。　　 2.探讨急性ITP患儿外周血淋巴细胞PPAR-γ mRNA表达的变化与IL-2、IL-13的相关性,分析PPAR-γ在急性ITP发病机制中对IL-2、IL-13的作用。　　 3.探讨配体活化的PPAR-γ对Jurkat T细胞NO/NOS表达的影响,分析其与调节Th1/Th2细胞失衡之间具体的作用机制。　　 4.为临床上治疗急性ITP提供新的药物和靶点提供理论依据,并可能为临床上治疗其它Th1/Th2细胞分化失衡的自身免疫性疾病提供新的思路。　　 [方法]　　 1.外周血T淋巴细胞的分离　　 取急性ITP患者及正常对照体检者外周静脉血,枸椽酸钠抗凝。淋巴细胞分离液常规分离外周血中单个核细胞,置玻璃培养皿中孵育去除单核细胞,加入NH4Cl溶液溶解红细胞,经T细胞分离富聚柱获得纯化的T细胞。加入10％新生牛血浆Hanks液重悬T细胞,调整T细胞浓度至2×106/ml。FITC标记的抗CD3单克隆抗体检测其纯度,台盼蓝拒染法检测其活性。　　 2.Th1/Th2相关细胞因子IL-2、IL-10、IL-13、INF-γ含量的检测　　 酶联免疫吸附试验法(ELISA)测定血浆中INF-γ、IL-2、IL-10和IL-13的水平,按试剂盒说明书操作,用酶联免疫检测仪以450nm比色,测吸光度(OD)值,以标准曲线法计算样本浓度,以pg/ml表示。　　 3.PPAR-γ mRNA的检测　　 T淋巴细胞悬液抽提总RNA,一步法特异性扩增PPAR-γ mRNA,以β-actin为内参,琼脂糖凝胶电泳RT-PCR的扩增产物,采用凝胶成像系统扫描PPAR-γ/β-actin mRNA的条带,测得条带灰度值,以PPAR-γ/β-actin的灰度比值表示其mRNA表达的相对水平。　　 4.PPAR-γ活化剂调节对NO/NOS的作用研究　　 Jurkat T细胞培养于RPMI1640培养。PHA(5μg/ml)活化Jurkat T细胞24h后,调整细胞浓度为5×106/ml,培养于24孔细胞培养板。(1)时间效应:分成对照组和实验组,每个实验组和对照组设5个重复。实验组加入20umol/l药物罗格列酮,对照组不加药物,CO2培养箱培养6h、12h、18h、24h和30h。(2)浓度效应:随机分六组(对照组和1umol/l、5umol/l、10umol/l、15umol/l、20umol/l罗格列酮实验组,每组设5个重复),对照组不加药物,CO2培养箱培养12h。　　 5.Jurkat T细胞培养液中NO水平的检测　　 收集细胞培养液离心沉淀,匀浆后取上清液,按照硝酸还原酶法测量NO含量。　　 6.Jurkat T细胞中NOS活性的测定　　 严格按照一氧化氮合酶测定试剂盒说明书进行操作,最后测各管的吸光度值,利用计算公式计算出总NOS的活性。　　 [结果]　　 1.分离纯化所得T淋巴细胞的纯度和活性均大于95%。　　 2.与正常对照组相比,急性ITP患者外周血INF-γ含量降低,IL-10含量升高;T-bet mRNA表达下降,而GATA-3 mRNA表达增强,Th1/Th2细胞因子及相关转录因子表达比例明显降低。　　 3.急性ITP患儿外周血淋巴细胞PPAR-γ mRNA表达上升,血浆IL-2的含量显著低于正常对照组、而IL-13的含量显著高于正常对照组,PPAR-γ mRNA表达与血浆IL-2水平呈负相关,与IL-13水平呈正相关。　　 4.在Jurkat系T细胞内,PPAR-γ活化剂能够以时间和浓度依赖的形式增加NO生成,PPAR-γ活化剂能够以相同的方式增加NOS活性。　　 [结论]　　 1.本研究所采用的T细胞分离纯化方法可用于科学研究。　　 2.急性ITP是一种Th1/Th2细胞失衡相关(Th2细胞占优势)的自身免疫病。　　 3.急性ITP患儿发病机制中,PPAR-γ可能通过抑制IL-2的分泌,促进IL-13的生成来发挥免疫调节作用。　　 4.PPAR-γ激动剂罗格列酮可通过NO/NOS途径来发挥相应的生物学功能。