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结直肠癌是常见的恶性肿瘤之一,其发病是多因素、多基因、多分子信号参与的渐进性累积过程。《2014年世界癌症报告》中指出,在所有癌症中结直肠癌的全球病发率位居第三。在我国,结直肠癌的发病率逐呈年增高趋势并且已和世界平均水平相当,而治愈率未见明显改善。目前认为靶向蛋白分子药物的开发是治疗结直肠癌的新研究方向。核心蛋白聚糖是富含亮氨酸的小分子蛋白聚糖家族成员之一,作为抑癌因子与多种生长因子、细胞因子或细胞膜受体相互作用进而抑制肿瘤细胞生长、增殖,肿瘤血管生成,肿瘤迁徙和转移以及促进肿瘤细胞凋亡和自噬。机制研究表明,DCN与EGFR或ErbB2/4结合抑制肿瘤增殖和促进肿瘤细胞凋亡;与TGF-β结合抑制肿瘤血管生成;与Met受体结合或与E-cadherin结合抑制肿瘤细胞增殖和转移;与VEGFR2结合诱导肿瘤细胞自噬。由此可见,DCN的抗肿瘤作用是通过多信号通路实现的,对抑制肿瘤的发生发展具有重大作用。活化素C是转化生长因子β(TGF-β)超家族成员之一,由于发现较晚,对其生物学活性研究也相对较少且主要集中于肝脏。认为活化素C具有促进肝脏细胞DNA合成和肝再生的功能。近些年,活化素C在其它组织中的生物学功能相继被报道,然而在结直肠癌中对其生物学活性的研究未见报道。本实验组的早期研究数据表明,DCN缺失小鼠易形成自发性肠道肿瘤,而体外转染DCN表达质粒显著抑制结直肠癌细胞的增殖和转移。本研究作为一项延续性研究,进一步探究DCN抑制结直肠癌发生发展的新机制。基于活化素C介导的Activins/Smad信号通路和TGF-β1介导的TGF-β信号通路在结直肠癌细胞中都为失活状态以及DCN直接结合TGF-β1抑制其促进结直肠癌细胞的增殖和血管生成的理论依据,我们展开对DCN与活化素C的调控关系研究。分别在体内体外探讨DCN缺失和转染DCN表达质粒对活化素C及相关蛋白的影响;以及在体外分别探讨活化素C在结直肠癌中的生物学活性及可能机制、DCN是否及如何影响活化素C介导的信号转导通路相关蛋白及二者之间的分子交互作用。结果表明:(1)DCN负调节活化素C首先,采用DCN缺失小鼠模型探究DCN缺失对活化素C及相关蛋白的影响。Western blot检测发现,DCN缺失小鼠的肠上皮细胞中活化素C蛋白水平显著升高。进一步采用转染DCN表达质粒的方法在HCT116和HEK293细胞中研究DCN对活化素C表达及蛋白稳定性的影响,发现在这两种细胞中转染DCN表达质粒均可明显抑制活化素C的表达并且促进活化素C蛋白的降解。因此,结合体内外数据证明DCN负调节活化素C。(2)活化素C激活MAPK上调AP-1促进HCT116细胞增殖、迁徙和转移我们采用重组活化素C蛋白处理、活化素C表达质粒转染以及RNA干扰三个层面来探究活化素C对HCT116细胞的生物学活性及可能机制。MTT联合细胞周期检测、划痕和细胞小室实验证明重组活化素C和转染活化素C表达质粒均能上调CDK4和Cyclin D1,促进划痕愈合和细胞转移,而RNA干扰活化素C得到相反结果,揭示活化素C促进HCT116细胞增殖、迁徙和转移。在机制研究中发现,活化素C并非通过Activins/Smad信号通路,而是通过ERK/c-Fos和JNK/c-Jun信号通路上调AP-1,继而促进HCT116细胞增殖、迁徙和转移,并且活化素C上调AP-1与caveolin-1相关。(3)部分活化素C参与DCN负向调控ERK/c-Fos和JNK/c-Jun信号通路首先,采用转染DCN表达质粒的方法研究DCN对活化素C介导的信号通路的影响。Western blot检测发现,在HCT116和HEK293细胞中转染DCN表达质粒明显降低ERK磷酸化水平并且下调AP-1蛋白表达,表明DCN负向调控ERK/c-Fos和JNK/c-Jun信号通路。此外,采用转染DCN表达质粒结合RNA干扰活化素C的方法进一步研究DCN抑制活化素C与负向调控ERK/c-Fos和JNK/c-Jun信号通路的关系,发现RNA干扰活化素C后,DCN仍然下调AP-1蛋白的表达,同时caveolin-1大幅度增加,表明DCN负向调控ERK/c-Fos和JNK/c-Jun信号通路是通过部分抑制活化素C实现的,并且与caveolin-1相关。(4)DCN与活化素C相互结合采用免疫共沉淀的方法,研究DCN与活化素C的分子交互作用,结果表明DCN与活化素C相互结合。进一步采用荧光共定位的方法研究这种结合在细胞中的发生部位。我们将HCT116细胞共转染红色荧光蛋白标记的DCN表达质粒与绿色荧光蛋白标记的活化素C表达质粒,激光共聚焦显微镜分析表明,DCN与活化素C的相互结合发生于HCT116细胞的外基质中。综上所述,本研究首次发现了活化素C在结直肠癌中的生物学活性及机制,认为活化素C通过激活ERK/c-Fos和JNK/c-Jun信号通路上调AP-1,促进人结直肠癌HCT116细胞的增殖、迁徙和转移。此外,DCN结合于活化素C促进活化素C蛋白降解,通过部分抑制活化素C负向调控ERK/c-Fos和JNK/c-Jun信号通路并且与caveolin-1相关。因此,DCN抑制结直肠癌细胞增殖、迁徙和转移与活化素C相关。