黑色素广泛的存在于动植物及微生物中,是由酪氨酸酶催化酪氨酸而生成的一种非均质类的多酚聚合物,具有吸收紫外辐射、清除自由基、抗氧化、吸附重金属离子、清除酚类化合物、作为新型的药物载体等生理功能,此外,有研究表明黑色素在体外具有抗HIV活性,正是由于黑色素的应用价值使其在医药、化工、农药等方面有广阔的应用前景。虽然黑色素来源广泛,但是较低的产量使黑色素的价格居高不下,进而限制其大规模的应用。为此,本论文采用传统育种的方法,从环境中筛选获得了一株黑色素高产菌株,结合蛋白工程、基因工程、代谢工程等技术进行了一系列有益研究工作:(1)以酪氨酸为底物,从自然界中筛选获得一株色素高产菌株SC-1,经过紫外、红外、质谱、核磁共振等检测手段证明该色素为黑色素,依据《链霉菌鉴定手册》的生理生化、培养特征及以16S r RNA序列为基础的分子生物学鉴定手段,将菌株SC-1鉴定为S.kathirae。经128 h发酵,黑色素产量为0.8 g·L-1。(2)在摇瓶水平上优化Streptomyces kathirae产黑色素发酵条件,并且采用响应面优化S.kathirae产黑色素发酵培养基,确定S.kathirae SC-1产黑色素的最适发酵条件及最适培养基。培养基(g·L-1):可溶性淀粉4,酵母膏37,Na Cl 5,Ca Cl20.1,Cu SO4·5H2O1.341×10-2;培养条件:初始p H 6.0、温度28°C、转速200 r·min-1、接种量8%,发酵时间128 h。在此条件发酵,黑色素产量可达13.7 g·L-1,生产强度为0.11 g·L-1·h-1,较优化前提高17.13倍。(3)通过(NH4)2SO4分级沉淀、强阴离子交换柱纯化获得S.kathirae酪氨酸酶。SDS-PAGE测定酪氨酸酶分子量为30 k Da,以左旋多巴为底物测定酪氨酸酶最适反应p H为6.2,最适反应温度为45°C。Co2+、Ni2+和Cu2+对酪氨酸酶具有抑制作用,但是当Cu2+浓度为30μmol·L-1时,对氨酸酶酶活有促进作用,酪氨酸酶酶活可为未添加Cu2+活性的7.2倍。其他金属离子在一定浓度范围内对酪氨酸酶酶活具有促进作用,作用大小的顺序为Al3+>Mn2+>K+>Fe3+>Na+>Zn2+>Ba2+>Ca2+。硫脲、Tween-80、Triton X-100等添加剂在一定浓度范围内对酶活有促进作用,抗坏血酸、β-巯基乙醇、二硫苏糖醇、等添加剂对酶活有强烈抑制作用。以左旋多巴为底物酶动力学常数Km为0.42 mmol·L-1;Vmax为333.38μmol·mg-1·min-1。(4)以酪氨酸酶部分氨基酸序列为基础,使用TAIL-PCR等分子生物学手段克隆获得酪氨酸酶编码基因及其5’端非编码序列(553 bp),mel C包含酪氨酸酶金属伴侣基因mel C1及酪氨酸酶基因mel C2,与以报道的酪氨酸酶编码基因的最高同源性为84%。在S.lividans中验证克隆获得的mel C基因功能,证明只有共表达酪氨酸酶金属伴侣与酪氨酸酶才可以得到有活性的酪氨酸酶。同时通过启动子缺失实验在S.lividans中验证上游553 bp功能,证明mel C启动子的有效序列位于-167 bp至-75 bp之间。为提高黑色素产量,在S.kathirae表达mel C基因使黑色素产量从13.7 g·L-1提高至28.8 g·L-1。(5)在E.coli BL21中使用双RBS的表达策略优化酪氨酸酶金属伴侣及酪氨酸酶的表达量,同时对重组大肠杆菌产酪氨酸酶的条件进行了优化,当诱导温度为16°C、IPTG浓度为0.4 mmol·L-1、诱导时间为8 h时重组菌可以较好的生成重组酪氨酸酶。对重组酪氨酸酶酶学性质进行了研究发现其与野生型酪氨酸酶酶学性质并无太大区别。(6)为提高S.kathirae酪氨酸酶稳定性,利用SWISS-MODEL以栗色浑圆链霉菌(S.castaneoglobisporus)酪氨酸酶(2AHL)为模板对S.kathirae酪氨酸酶的三维结构进行同源模拟,获得了酪氨酸酶的三维结构。使用在线预测软件Po PMu Si C-2.1计算酪氨酸酶每个突变氨基酸的去折叠自由能变化(ΔΔG)来辅助设计提高酪氨酸酶的稳定性,确定与酪氨酸酶稳定性相关的关键位点,将这些关键位点进行相应的替换,获得了热稳定性提高的突变体Q7K、R95Y、G123W、G234P。在此基础上进行组合突变,使酪氨酸酶的热稳定性进一步提高,最适温度提高了10°C、T50提高了10°C,在60、65、70、75°C下的半衰期分别提高了3.52、3.18、3.29、3.14倍。在S.kathirae中表达酪氨酸酶突变体使黑色素产量进一步提高至32.6 g·L-1。