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口蹄疫（Foot-and-mouth disease,FMD）是由口蹄疫病毒（Foot-and-mouth disease virus,FMDV）引起的一种急性、热性、高度接触性动物传染病,传播迅速、发病率高,对发病地区的政治和经济有着巨大负面影响。传统灭活疫苗的免疫接种是当前预防和控制FMD最为有效的手段,但免疫后难以与自然感染动物进行区分,致使我国FMD无法得到彻底地控制和净化,因此需要发展能够区分自然感染和疫苗免疫的FMD标记疫苗。为了发展复制性能优良的FMD标记病毒疫苗候选株,本论文进行了以下三部分的研究:1.利用丙氨酸扫描的方法成功构建了含FMDV rvOZK/93-08 3B123蛋白以及其突变体的16个真核表达质粒（S1S16）,转染BHK-21细胞,24h后对转染细胞用实验室前期筛选、保存的一株抗FMDV 3B的单克隆抗体3B4B1进行间接免疫荧光和免疫印迹分析。结果显示除S12表达的3B突变蛋白消除了与单抗3B4B1的结合能力外,其余表达的3B突变蛋白均能与单抗3B4B1发生特异性结合,表明单抗3B4B1识别的FMDV 3B蛋白关键氨基酸位于3B1和3B2的2PY-GP6中。2.在已构建的FMDV疫苗株pOZK/93-08感染性克隆的基础上,针对3B1和3B2的2PY-GP6做了一系列突变修饰,构建了6株含3B蛋白不同突变的全长重组质粒,Not I线化后分别转染表达T7 RNA聚合酶的BSR/T7细胞,共拯救到3株重组病毒。将重组病毒以及亲本毒株接种BHK-21细胞后,分别用单抗3B4B1进行间接免疫荧光和免疫印迹分析,结果显示含3B1和3B2突变（4AGP6→4TAA6）的重组病毒rvO/TAA完全消除了与单抗3B4B1的结合能力,而其余病毒均能与该单抗发生特异性结合。进一步分析重组病毒rvO/TAA和亲本病毒的一步生长曲线,蚀斑表型以及遗传稳定性,结果表明rvO/TAA具有与亲本病毒相似的复制能力和噬斑表型,3B12蛋白的突变（4AGP6→4TAA6）对病毒复制无明显影响;rvO/TAA经过20次细胞传代后,RT-PCR测序显示突变的氨基酸稳定存在。3.成功构建含FMDV 3B1和3B2突变（4AGP6→4TAA6）的3B蛋白原核表达质粒,在BL21细菌中诱导表达、纯化后,连同实验室保存的FMDV rvOZK/93-08 3B蛋白进行浓缩,并用单抗3B4B1进行免疫印迹分析,结果同样显示含3B1和3B2突变（4AGP6→4TAA6）的O/TAA-3B蛋白不能与单抗3B4B1发生特异结合,而未突变的OZK-3B蛋白能够与该单抗发生特异性结合,说明3B1和3B2的突变（4AGP6→4TAA6）取消了与单抗单抗3B4B1结合能力。另外经ISA201佐剂乳化后分别免疫豚鼠和小鼠制备血清,用实验室建立的3B阻断ELISA方法进行了初步检测分析,结果显示突变3B蛋白制备的多组血清阻断值偏高（PI>50%）,推测其原因在于单抗识别位点的临近位置存在干扰表位,或是原核表达蛋白的免疫原性同真核存在差异,表明配套诊断方法仍待进一步完善。综上,本研究成功鉴定了抗FMDV 3B蛋白单抗3B4B1识别的关键氨基酸,并通过口蹄疫病毒的反向遗传操作技术,成功构建了一株与亲本病毒复制能力相似的重组标记病毒,该病毒的成功构建为未来FMD标记疫苗的发展提供了材料。