【摘 要】
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目的:通过探讨人细小病毒B19非结构蛋白NS1转染人慢性髓性白血病细胞K652后GATA1、GATA2表达的变化,及引起GATA1、GATA2表达变化的分子调控机制来证实人细小病毒B19 NS1有可能参与了Notch-Hes信号通路激活,或直接进入宿主细胞核内负性调控GATA1、GATA2相关核转录,从而抑制红细胞的分化与成熟,探索出NS1蛋白在抑制红系祖细胞分化和成熟中一种重要的基于NS1-He
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目的:通过探讨人细小病毒B19非结构蛋白NS1转染人慢性髓性白血病细胞K652后GATA1、GATA2表达的变化,及引起GATA1、GATA2表达变化的分子调控机制来证实人细小病毒B19 NS1有可能参与了Notch-Hes信号通路激活,或直接进入宿主细胞核内负性调控GATA1、GATA2相关核转录,从而抑制红细胞的分化与成熟,探索出NS1蛋白在抑制红系祖细胞分化和成熟中一种重要的基于NS1-Hes-GATA新的调控机制。方法:通过人工构建人细小病毒B19 NS1重组表达质粒p NS1-HA,并转染人慢性髓性白血病细胞K652,建立瞬时表达模型作为重组质粒组,同时建立空载质粒对照组、空白细胞对照组,在转染后各个时段收集细胞,Real-time PCR检测各组Notch1、Hes1、Hes5、GATA1、GATA2 m RNA表达的变化,Western blot检测蛋白表达的变化;si RNA抑制Notch1,Hes1、Hes5,Western blot检测GATA1、GATA2蛋白表达水平;免疫荧光及共聚焦显微镜观察目的蛋白在细胞内定位。结果:1.重组质粒p NS1-HA经Bam HI、Xba I双酶切后释出的插入片段,相对分子量为2031bp。空载质粒经双酶切后未见目的基因片段。转染重组质粒p NS1-HA转染的K562细胞可见目的蛋白表达,相对蛋白分子量分别为78KD。空载质粒转染的K562细胞或未进行质粒转染的K562细胞中未见目的蛋白表达。2.与0小时相比,p NS1-HA转染K56细胞2小时后,GATA1编码基因的m RNA表达降低,转染后4小时达到最低峰,仅为0小时的0.1倍,转染后6、8、24小时呈现持续性低表达状态（P<0.05）。p NS1-HA转染K562细胞4小时后,GATA2编码基因的m RNA表达增高,在转染后6、8小时持续增高,24小时达到高峰,仅为0小时的8倍（P<0.05）。与空白细胞相比,p NS1-HA转染后2小时,GATA1蛋白表达降低,在转染后4、6、8、24小时持续降低,在转染后24小时达到最低峰,仅为空白细胞的0.1倍（P<0.05）。GATA2蛋白则相反,从转染后2小时开始增高,4、6、8、24小时持续增高,在转染后24小时达到最高峰,为空白细胞的2.9倍（P<0.05）。3.与空白K562细胞相比,p NS1-HA质粒转染24小时后的K562细胞,Notch1基因编码的蛋白胞内段NICD、HES1蛋白、HES5蛋白表达均增高,分别为空白对照组的1.7倍、2.0倍、1.9倍（P<0.05）。空载质粒转染24小时后K562细胞中NICD、HES1、HES5蛋白的表达均无明显变化（P>0.05）。4.与空白细胞相比,转染si-Notch、si-Hes1、si-Hes5的K562细胞GATA1及GATA2蛋白的表达均明显增高（P<0.05）。5.p NS1-HA转染经si-Notch1预处理的细胞,GATA1的表达明显较p NS1-HA转染未经si-Notch预处理的细胞增高（P<0.05）。与空白细胞相比,p NS1-HA转染si-Notch1预处理的细胞,GATA1的表达无明显变化（P>0.05）。p NS1-HA转染经si-Hes1预处理的细胞,GATA1的表达明显较p NS1-HA转染未经si-Hes1预处理的细胞上调,且上调效果较si-Notch1、si-Hes5预处理的细胞高（P<0.05）6.p NS1-HA转染的K562细胞制作的滴片于荧光显微镜下,可见CY3标记的HA二抗红色荧光信号,其中大部分与DAPI标志的细胞核重叠。空白细胞对照未见CY3荧光信号。结论:人细小病毒B19 NS1重组表达质粒p NS1-HA构建成功,转染K562细胞可表达NS1-HA蛋白。p NS1-HA转染K562细胞后可下调GATA1、上调GATA2的表达。其中,p NS1-HA下调GATA1的表达是通过激活Notch1-Hes1/Hes5信号通路来进行的。K562细胞转染p NS1-HA后,NS1-HA在细胞质及细胞核中均有表达,主要在细胞核中表达。
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